細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基,，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 min,。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,，進(jìn)行細(xì)胞固定,，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細(xì)胞通透,。5) 除去Triton X-100,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）,。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液,，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過夜,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控,。synaptophysin免疫熒光染色

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4，較大吸收光波長為490495nm,，較大發(fā)射光波長520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末,，不溶于水,，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光,。synaptophysin免疫熒光染色熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術(shù)的范疇。

免疫熒光間接法測抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4h,，時(shí)間過長，會使熒光減弱,。2）每次試驗(yàn)時(shí),，需設(shè)置以下三種對照：①陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤,，避免干燥,。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,，避免因放置不平使液體流失,，從而造成非特異性熒光染色。

免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔,；18mm12孔,；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min,。使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù),。

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法,。免疫熒光測定：抗原抗體反應(yīng)后,，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng),。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高,，非特異性熒光染色少,。缺點(diǎn)是敏感性偏低,；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌,、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢,、皮膚活檢的免疫病理檢查。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合,，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測,。synaptophysin免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)通過熒光信號的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位。synaptophysin免疫熒光染色

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶,；孵育過程中干片,；抗原熱修復(fù)過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高,；染色試濃度過高或孵育時(shí)間過長,；染色劑濃度過高或孵育時(shí)間過長。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,，但若檢測抗原是水不溶性蛋白,，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號,；建議設(shè)陰性對照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色,；選擇醛類固定液時(shí),，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用,，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高,。synaptophysin免疫熒光染色