細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,，PBS洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小,，因此夾取的時(shí)候要小心,，注意 反正面，放在皿里洗比較方便,，避免了來(lái)回夾取,，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來(lái),。洗的時(shí)候我都是多加PBS,，稍晃一下就倒掉，沒(méi)有等5分鐘或10分鐘,。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,，PBS洗三遍,。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍,。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)夜,，也可37度2小時(shí)，感覺(jué)前者效果好,，PBS洗三遍,。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí),，PBS洗三遍,。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片,。8. 蒸餾水洗掉PBS,，甘油封片，指甲油封片子的四周,，因?yàn)楦视筒幌髽?shù)脂那樣會(huì)干,，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和信號(hào)通路。CD86免疫熒光分析

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長(zhǎng)（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過(guò)短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長(zhǎng)發(fā)射光子,，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過(guò)顯微鏡觀察到,。熒光團(tuán)可以通過(guò)可見(jiàn)光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場(chǎng)上購(gòu)買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長(zhǎng)范圍,。它們不會(huì)損傷活細(xì)胞,，可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)時(shí),，首先對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理,。進(jìn)行免疫染色時(shí)，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號(hào),。根據(jù)使用的抗體和所需的信號(hào)擴(kuò)增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。CD86免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用,。

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位，以及一些特殊信號(hào)分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過(guò)程中,，需要用到細(xì)胞爬片，通過(guò)將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),，細(xì)胞在爬片上生長(zhǎng),，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片,。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大,；與直接免疫熒光相比，通過(guò)信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度,。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。

細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打,，使之成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù),。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上,，壓緊，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起,，造成雙層細(xì)胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后,，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度快慢，觀察判斷細(xì)胞密度,，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光,。免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于檢測(cè)和定位特定抗原或抗體,。

細(xì)胞免疫熒光步驟對(duì)大家來(lái)說(shuō)一定是很陌生的,，他是一種抗原抗體反應(yīng)，好像對(duì)我們來(lái)說(shuō)他顯得很遙遠(yuǎn)的樣子,，因?yàn)槲覀儾⒉涣私馑茏鍪裁?，通過(guò)這種技術(shù)可以讓我們對(duì)抗原或抗體的性質(zhì)、定位一次來(lái)分析出更多的數(shù)據(jù),。細(xì)胞免疫熒光,，這對(duì)很多人來(lái)說(shuō)都是一次聽(tīng)說(shuō)這個(gè)東西，也不知道他對(duì)我們會(huì)有什么好處與壞處,，科學(xué)研究就是這樣子的,，普通老百姓是不會(huì)明白其中的道理的，但是這些研究也是確實(shí)的在我們的生活中取得了成果,，能夠讓大家過(guò)的更加舒適,。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè),。HMGB1免疫抗體

免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。CD86免疫熒光分析

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1、建議細(xì)胞直接種孔板,，采用倒置熒光顯微鏡拍照,，這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果；2,、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡,，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。建議直接購(gòu)買處理過(guò)的細(xì)胞爬片,；若只有普通細(xì)胞爬片,，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng)，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過(guò)夜,，若用酸浸泡過(guò)夜,，第二天先用自來(lái)水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟,。然后,，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片,。置于烘箱 80 ℃ 烘干,，再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用。CD86免疫熒光分析