免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測定相反）；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）,；熒光染料的光穩(wěn)定性,。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,，以及利用定量技術(shù)測定含量,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。r-H2AX免疫抗體

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法,。免疫熒光測定：抗原抗體反應(yīng)后,，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法。免疫熒光實驗步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng),。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高,，非特異性熒光染色少,。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體,。此法常用于細(xì)菌,、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查,。CY3免疫熒光早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中，需要用到細(xì)胞爬片,，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),，細(xì)胞在爬片上生長，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光,。實驗前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片,。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號放大；與直接免疫熒光相比,，通過信號放大提高檢測靈敏度,。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。

細(xì)胞免疫熒光實驗注意事項：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶,；孵育過程中干片,；抗原熱修復(fù)過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高,；染色試濃度過高或孵育時間過長,；染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,，但若檢測抗原是水不溶性蛋白,，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號,；建議設(shè)陰性對照組,，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時,，保持其新鮮度,，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程,。

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm,，較大發(fā)射光波長520--530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,，不溶于水,，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光,。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。CY3免疫熒光

免疫熒光技術(shù)可以通過熒光信號顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì),。r-H2AX免疫抗體

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,，避光室溫孵育10min,。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,，發(fā)射波長420nm,，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長465-495nm,，發(fā)射波長515-555nm,，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm,，發(fā)紅光）。兩種抗體同時孵育：由于FIT容易萃滅,，因此在孵育抗體時后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光,。r-H2AX免疫抗體