熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末,，不溶于水,，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長(zhǎng)期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm,，呈橘紅色熒光,。免疫熒光技術(shù)中，以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的方法被稱(chēng)為熒光抗體技術(shù),。IL-10免疫熒光染色

免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)），0.5%TritonX-100(一種去垢劑,，用PBS配制)室溫通透20min（針對(duì)胞內(nèi)抗原,，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）；除了TritonX-100,，也可作為通透劑,，并且固定后的樣品不需要通透。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合）,，通透后用PBS浸洗玻片3次,，每次3min，吸水紙吸干PBS,，在玻片上滴加山羊血清,，室溫封閉30min,。常用的封閉液包括：與二抗同一來(lái)源的血清、BSA或者是羊血清,。從封閉開(kāi)始所有的步驟,，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥,，否則極易產(chǎn)生較高的背景,。醛類(lèi)固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉,。PD-L1免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期,。

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍，可以測(cè)定內(nèi)分泌,、蛋白質(zhì),、多肽、核酸,、神經(jīng)遞質(zhì),、受體、細(xì)胞因子,、細(xì)胞表面抗原,、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類(lèi)別,，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌,、藥物檢測(cè),、免疫學(xué)、血型鑒定等,。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱(chēng)為免疫熒光色素或熒光染料,。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,。

細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打,，使之成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板,，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基，然后將爬片置于液滴上,，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起,，造成雙層細(xì)胞貼片,。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi)。3)24h或者48h后,，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度快慢,，觀察判斷細(xì)胞密度，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光,。熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化,，有助于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí),，動(dòng)作應(yīng)輕柔,，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程,。（2）種細(xì)胞過(guò)程中,，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過(guò)密,。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過(guò)程中注意避光,。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后,，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅,?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時(shí)保存于4度冰箱,，盡快拍照,。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí)，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性,，可以實(shí)現(xiàn)精確的免疫檢測(cè),。IL-10免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活,。IL-10免疫熒光染色

免疫熒光法是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位,。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱(chēng)為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位。IL-10免疫熒光染色