免疫熒光實驗步驟：1.樣本準備：細胞或薄組織。對單層生長細胞,，在傳代培養(yǎng)時,，將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次,；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本,，目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結(jié)合,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。PDL-1/CD274免疫熒光檢查

熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,，總或多或少地以其他形式釋放,。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比,。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）,。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外,，也與激發(fā)光的波長有關(guān),。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）,，即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰,。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時,，得到的熒光強度也較大,。MBP免疫抗體免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。

細胞免疫熒光：細胞種板與細胞爬片制備：1) 細胞密度在90%-95%左右,，用預(yù)熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打，使之成單細胞懸液,，計數(shù),。2)取細胞培養(yǎng)12孔板，在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個孔里準備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細胞懸液時爬片漂起，造成雙層細胞貼片,。根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后，根據(jù)細胞生長速度快慢,，觀察判斷細胞密度,，約90%時進行細胞免疫熒光。

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光,；FITC激發(fā)波長465-495nm,，發(fā)射波長515-555nm，發(fā)綠光,；CY3激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光）,。兩種抗體同時孵育：由于FIT容易萃滅,，因此在孵育抗體時后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標記免疫技術(shù),。

免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4h，時間過長,，會使熒光減弱,。2）每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照：①陽性對照：陽性血清+熒光標記物②陰性對照：陰性血清+熒光標記物③熒光標記物對照：PBS+熒光標記物3.已知抗原標本片需在操作的各個步驟中,，始終保持濕潤,，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物,，應(yīng)始終保持在已知抗原標本片上,，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色,。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術(shù)的范疇,。MBP免疫抗體

免疫熒光技術(shù)中，以熒光物質(zhì)標記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù),。PDL-1/CD274免疫熒光檢查

熒光標記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低,。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比,，時間更長（操作步驟更多）,。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度,；熒光標記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低,。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比,，時間更長（操作步驟更多）,。PDL-1/CD274免疫熒光檢查