免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性,，初次試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L,，pH7.4的PBS。②特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體,，再加熒光標記的特異性抗體,。③陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,，陽性對照和待檢標本呈強熒光,，則為特異性陽性染色。一般標本在高壓汞燈下照射超過3min,，就有熒光減弱現(xiàn)象,，經(jīng)熒光染色的標本較好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長,，熒光強度會逐漸下降,。熒光抗體標記使得抗原定位變得可視化,，有助于觀察細胞結(jié)構(gòu)和功能。cyclinD1免疫

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時,，動作應(yīng)輕柔,，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程,。（2）種細胞過程中,，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細胞局部生長過密,。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光,。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后,，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅,?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時保存于4度冰箱,，盡快拍照,。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色,，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。cyclinD1免疫免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點和作用機制,。

免疫熒光技術(shù)的主要特點是：特異性強,、敏感性高、速度快,。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決,，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜,。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比,，熒光免疫法無放射性污染,，并且大多操作簡便，便于推廣,。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題,，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難,。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣,，在臨床檢驗中應(yīng)用,。

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍，可以測定內(nèi)分泌,、蛋白質(zhì)、細胞因子,、細胞表面抗原,、多肽、核酸,、受體,、神經(jīng)遞質(zhì)、肉瘤標志物,、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病,、內(nèi)分泌,、藥物檢測、免疫學(xué),、血型鑒定等,。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次。封閉：使用封閉液對樣本進行封閉,，一般1h,。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理,，根據(jù)說明書使用合適的濃度，避光處理1h（后面步驟均需避光）,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。封片：滴一滴防淬滅劑，封片,?？闪⒓从^察后暫存4℃盡快觀察。免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合,，通過抗原抗體反應(yīng)進行定位,。

免疫熒光注意事項：對照實驗的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì)，會產(chǎn)生背景熒光,，對結(jié)果產(chǎn)生影響,，例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前,，應(yīng)對樣品進行觀察,，確保抗原本身沒有信號,。2,、陽性對照：用確認含有待測抗原的組織或細胞，與待測標本進行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽性,，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3,、陰性對照：與陽性對照相反,，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果,。熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實現(xiàn)精確的免疫檢測,。NEUN免疫組化

免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達調(diào)控,。cyclinD1免疫

熒光素標記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中,，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,，使然后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10,，混勻,，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min,。②熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量,，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末,。③結(jié)合（或稱標記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完），加畢后,，繼續(xù)攪拌12～18h,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時添冰去水,；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中,。cyclinD1免疫