細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見問題:1,、信號弱或者無信號：細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過長；2）抗體濃度不合適,，參照抗體說明書的稀釋濃度,，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索；3）一抗孵育時(shí)間不合適,，建議 4 ℃ 過夜孵育,。2、高背景：封閉不充分,；抗體濃度過高,；抗體孵育時(shí)間過長或溫度過高；清洗不充分,；樣本變干,，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留,，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸,，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留,，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附,。COL-2免疫熒光檢查

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍,。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小,，因此夾取的時(shí)候要小心，注意 反正面,，放在皿里洗比較方便,，避免了來回夾取，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖,，不要細(xì)胞沖下來,。洗的時(shí)候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉,，沒有等5分鐘或10分鐘,。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍,。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,，PBS洗三遍,。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍,。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜,，也可37度2小時(shí)，感覺前者效果好,，PBS洗三遍,。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí),，PBS洗三遍,。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片,。8. 蒸餾水洗掉PBS,，甘油封片，指甲油封片子的四周,，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干,，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。COL-2免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期,。

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù),。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功,。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1,、建議細(xì)胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照,，這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果；2,、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡,，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片,。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片；若只有普通細(xì)胞爬片,，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng),，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜,，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟,。然后,，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片,。置于烘箱 80 ℃ 烘干,，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用。熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位各種抗原,，也可以用于檢測和定位抗體,。

免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)），0.5%TritonX-100(一種去垢劑,，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內(nèi)抗原,，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）；除了TritonX-100,，也可作為通透劑,，并且固定后的樣品不需要通透。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合）,，通透后用PBS浸洗玻片3次,，每次3min，吸水紙吸干PBS,，在玻片上滴加山羊血清,，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清,、BSA或者是羊血清,。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕,，避免樣品的干燥,，否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品,，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉,。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來定位抗原的技術(shù)。COL-2免疫熒光檢查

免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。COL-2免疫熒光檢查

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm,，較大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。COL-2免疫熒光檢查