細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1、建議細(xì)胞直接種孔板,，采用倒置熒光顯微鏡拍照,，這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果；2,、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡,，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片,；若只有普通細(xì)胞爬片,，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng)，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜,，若用酸浸泡過夜,，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟,。然后,，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片,。置于烘箱 80 ℃ 烘干,，再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全,。BGLAP/OCN免疫

熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低,。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比,，時(shí)間更長（操作步驟更多）。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大,；與直接免疫熒光相比,，通過信號(hào)放大提高檢測靈敏度；熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比,，成本較低。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加,；與直接免疫熒光相比，時(shí)間更長（操作步驟更多）,。CD80免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)可以用于研究遺傳疾病和基因表達(dá)調(diào)控。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子,，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會(huì)損傷活細(xì)胞,，可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測時(shí),，首先對細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理,。進(jìn)行免疫染色時(shí)，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號(hào),。根據(jù)使用的抗體和所需的信號(hào)擴(kuò)增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究,，同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白和核酸固定,，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點(diǎn),。封閉細(xì)胞樣品,，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比,。蛋白封閉液有助于減少非特異染色,。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期。

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后,，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法,。免疫熒光測定：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法,。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng),。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便,、特異性高，非特異性熒光染色少,。缺點(diǎn)是敏感性偏低,；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌,、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查,。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法,。FITC免疫熒光檢查

熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實(shí)現(xiàn)精確的免疫檢測,。BGLAP/OCN免疫

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,，PBS洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心,，注意 反正面,，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取,，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖,，不要細(xì)胞沖下來。洗的時(shí)候我都是多加PBS,，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘,。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,，PBS洗三遍,。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,，PBS洗三遍,。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時(shí),，感覺前者效果好,，PBS洗三遍,。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí),，PBS洗三遍,。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片,。8. 蒸餾水洗掉PBS,，甘油封片，指甲油封片子的四周,，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干,，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。BGLAP/OCN免疫