其他熒光物質(zhì)：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm,，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3）,、鋱（Tb3）,、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3應(yīng)用較廣,。Eu3螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬,，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng),，較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。CTNT免疫熒光分析

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7,、4 37度 PBS 2小時(shí)。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min,。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘,。7. 一抗,，4度過(guò)夜，一般要大于18小時(shí)或者37度,，1-2小時(shí),。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時(shí),。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí),，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值，可以使用PBS多清洗幾次,，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間,，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí)。CTNT免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能,。

熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比,。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度,，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）,，即在某一特定波長(zhǎng)處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰,。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的較大吸收峰波長(zhǎng)，且測(cè)定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí),，得到的熒光強(qiáng)度也較大,。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來(lái)確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段,，則不需要通透,；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果；從加熒光二抗起,，后面所有操作步驟盡量避光,?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間，1~2 h 為宜,。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無(wú)/弱染色：烤片溫度過(guò)高,，推薦 56~60 ℃ 1~2 h,；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過(guò)低,，孵育是否時(shí)間過(guò)短等,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)用于顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。PCNA免疫檢測(cè)

免疫熒光技術(shù)可以通過(guò)熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號(hào),，從而確定目標(biāo)分子的存在和位置,。CTNT免疫熒光分析

熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中,，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,，使然后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10,，混勻,，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min,。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完）,，加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時(shí)添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫(kù)中,。CTNT免疫熒光分析