免疫熒光注意事項：對照實驗的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),，會產(chǎn)生背景熒光,，對結(jié)果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前,，應(yīng)對樣品進行觀察，確?？乖旧頉]有信號,。2、陽性對照：用確認含有待測抗原的組織或細胞,，與待測標本進行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽性，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠,。3,、陰性對照：與陽性對照相反,，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果,。免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用，可以用于檢測病原體,、肉瘤標志物等,。osteocalcin(ocn)免疫熒光染色

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm,，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）,、鋱（Tb3+）,、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用較廣,。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時間長,，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡,、顯微熒光分光光度計,、流式細胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡。osteocalcin(ocn)免疫熒光染色免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究,、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用,。

細胞免疫熒光實驗注意事項：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶；孵育過程中干片,；抗原熱修復(fù)過度,。染色過深：一抗?jié)舛冗^高；染色試濃度過高或孵育時間過長,；染色劑濃度過高或孵育時間過長,。通常實驗室先固定細胞再進行通透，但若檢測抗原是水不溶性蛋白,，可先通透再固定,，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白，進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號,；建議設(shè)陰性對照組,，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色,；選擇醛類固定液時，保持其新鮮度,，較好現(xiàn)配現(xiàn)用,，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高。

細胞免疫熒光：細胞種板與細胞爬片制備：1) 細胞密度在90%-95%左右,，用預(yù)熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打，使之成單細胞懸液,，計數(shù),。2)取細胞培養(yǎng)12孔板，在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個孔里準備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細胞懸液時爬片漂起，造成雙層細胞貼片,。根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后，根據(jù)細胞生長速度快慢,，觀察判斷細胞密度,，約90%時進行細胞免疫熒光。使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟,。

免疫熒光技術(shù)的主要特點是：特異性強,、敏感性高、速度快,。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決,，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜,。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比,，熒光免疫法無放射性污染,，并且大多操作簡便，便于推廣,。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,，有相當一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題,，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難,。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣,，在臨床檢驗中應(yīng)用,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達水平。nestin免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制,。osteocalcin(ocn)免疫熒光染色

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記而獲得成功,。這種以熒光物質(zhì)標記抗體而進行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合,，用于檢測或定位各種抗原,，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體,，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù),。以熒光抗體方法較常用,。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。osteocalcin(ocn)免疫熒光染色