一,、細胞冷凍保存1.材料：生長良好之培養(yǎng)細胞、新鮮培養(yǎng)基,、DMSO(SigmaD-2650),、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球計數(shù)盤與蓋玻片,、等速降溫機(KRYO10SeriesII)2,、冷凍保存方法：（1）傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16～18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時,，以防止胞內冰晶過大,，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,，惟存活率稍微降低一些,。（2）程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存,。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存,。細胞的凍存密度一般是多少?免疫細胞凍存液顏色

細胞凍存的操作步驟是什么配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液,；取對數(shù)生長期的細胞,，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗,。去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養(yǎng)皿表面）把單層生長的細胞消化下來,；離心1000rpm,，5min；去除胰蛋白酶,，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù),，調節(jié)凍存液中細胞的**終密度為5×106/ml～1×107/ml,；將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5ml,；在凍存管上標明細胞的名稱,，凍存時間及操作者；凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/min,；當溫度達-25℃以下時,，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時,，則可迅速浸入液氮中,。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，免疫細胞凍存液如何存儲細胞凍存主要步驟有哪些.

細胞冷存液若長期保存,，次日轉移到液氮中即可,。本產(chǎn)品是一款適用于貼壁細胞，懸浮細胞，干細胞的通用型細胞凍存液,。產(chǎn)品優(yōu)勢：1.化學成分明確,，無任何外源蛋白和血清，適用于各類動物細胞株凍存,。2.無需程序降溫,，細胞復蘇率90%以上。3.凍存細胞可直接存放于-80℃冰箱,，穩(wěn)定保存數(shù)年,。4.即用型產(chǎn)品，4℃可穩(wěn)定保存,。細胞凍存：1.收集融合率>90%的對數(shù)期的貼壁細胞或者懸浮細胞于離心管中,。2.1000rmp離心5分鐘，去除離心管中的上清液,，收集細胞沉淀,。3.加入適量細胞凍存液于離心管中，使細胞濃度為1x106～1x107cells/mL,。

細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融,，實驗證明這樣可以比較大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑,，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性,，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成,，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷,。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化,，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷,。細胞凍存和復蘇的原則：慢凍速融，這樣更加有利于保持細胞的活力,。凍存細胞不加任何保護劑,，會導致細胞內冰晶的產(chǎn)生，從而使細胞產(chǎn)生內源性的機械損傷,，引起細胞內環(huán)境滲透壓,，PH，電解質等的改變,，進而促使細胞死亡,。細胞凍存液在細胞建株和建系中，及時凍存原始細胞是十分重要的,。

解凍解凍后,，應該立即鋪板在預先包被好的培養(yǎng)皿中,。開始之前，提前準備好以下材料：試管,，恢復至室溫的培養(yǎng)基,，預先包被的培養(yǎng)板，確保整個解凍復蘇程序可以在**短的時間內完成,。注意：不要在37°C水浴中加熱培養(yǎng)基,。1.在37°C水浴中快速解凍，持續(xù)溫和的在水中晃動凍存管,，直到剩余少量細胞還處于結冰狀態(tài),。2.水浴中取出凍存管，用70%的酒精或異丙醇擦拭除菌,。3.用2mL的血清移液管把細胞懸液轉移到一個15mL的錐形試管,。注意：用2mL的血清移液管代替1mL的***頭可以減少細胞聚集體的分解。細胞凍存液的配方是什么?通用細胞凍存液廠家

細胞凍存液配制主要成分.免疫細胞凍存液顏色

細胞凍存常用凍存液的成分如下：20％血清（FBS）,、10％DMSO,、70％1640培養(yǎng)液；或90％血清（FBS）,、10％DMSO,，更可防止細胞內冰晶形成。將DMSO和FBS加入DMEM中,，各自含量占總體積的10%,，然后濾膜過濾后分裝保存?zhèn)溆谩Ｗ⒁馐马棧?.DMSO不用高壓滅菌;DMEM不能高溫高壓滅菌,，可以過濾除菌,。2.DMSO要用新的,而且要避光保存,。3.DMSO:含10%FBS的DMEM=1:9(體積比),。DMSO在凍存液中的作用：DMSO在4℃時對細胞無明顯毒性，分子量小,、溶解度大,、易透過細胞膜，降低細胞外未結冰溶液中溶質濃度,，使細胞免受高濃度溶質的損傷,細胞內水分也不會過分外滲,，避免了細胞過分脫水皺縮；DMSO與水分子結合,，可使冰點下降,，減少細胞內冰晶的形成，從而減少冰晶損傷,。免疫細胞凍存液顏色

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