細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的原則是：慢凍速融,，這樣更加有利于保持細(xì)胞的活力,。凍存細(xì)胞不加任何保護(hù)劑，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生,，從而使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的機(jī)械損傷,，引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境滲透壓，PH,，電解質(zhì)等的改變,，進(jìn)而促使細(xì)胞死亡。在過去的幾十年中,，科研工作者將培養(yǎng)基,、血清和DMSO按照一定的比例配制成凍存液，并配合手工使細(xì)胞從4℃,，-20℃,，-80℃到液氮中逐步轉(zhuǎn)移使其達(dá)到“慢凍”的效果。但這種自制的凍存液儲(chǔ)存時(shí)間一般比較短,，不能滿足時(shí)間跨度大的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的需求,。且這樣人力和時(shí)間成本大，人手操作的誤差和血清制品的批間差也給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來了不穩(wěn)定性,。細(xì)胞凍存液需要現(xiàn)用現(xiàn)配?上海細(xì)胞凍存液一次加多少

用以下方法凍存細(xì)胞:4℃放置15-30分鐘（一定不能省略該步驟,，否則凍存液無法完全滲透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞起保護(hù)作用）①緩速降溫方法（以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例,，冷凍細(xì)胞的過程中可以輔助實(shí)現(xiàn)緩慢降溫，以達(dá)到近似于1℃/分鐘）：-80℃過夜→液氮長期保存,。（不推薦在-80℃長期保存,；異丙醇易揮發(fā)，并且容易吸收空氣中的水分,，建議使用5次后更換）②逐步降溫法：-20℃保存2小時(shí),，然后-80℃中保存2小時(shí)，隨后可以在-196℃液氮中長期保存,。上海細(xì)胞凍存液一次加多少加入適量的細(xì)胞凍存液,，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1～10×106/ml,，置于凍存管中密閉,。

解凍解凍后，應(yīng)該立即鋪板在預(yù)先包被好的培養(yǎng)皿中,。開始之前,，提前準(zhǔn)備好以下材料：試管，恢復(fù)至室溫的培養(yǎng)基,，預(yù)先包被的培養(yǎng)板,，確保整個(gè)解凍復(fù)蘇程序可以在**短的時(shí)間內(nèi)完成。注意：不要在37°C水浴中加熱培養(yǎng)基,。1.在37°C水浴中快速解凍,，持續(xù)溫和的在水中晃動(dòng)凍存管，直到剩余少量細(xì)胞還處于結(jié)冰狀態(tài),。2.水浴中取出凍存管,，用70%的酒精或異丙醇擦拭除菌。3.用2mL的血清移液管把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一個(gè)15mL的錐形試管,。注意：用2mL的血清移液管代替1mL的***頭可以減少細(xì)胞聚集體的分解,。

3、步驟：（1）冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基,，使細(xì)胞處于指數(shù)生長期,。（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基,、血清,，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液,，置于室溫下待用,。（3）離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞,，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率,。（4）取與細(xì)胞懸液等量的凍存液,，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液，并晃動(dòng)試管,，制成細(xì)胞凍存懸液（DMSO***濃度為5～10％）,，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻,，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中,，1～2ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè),。嚴(yán)密封口后,，注明細(xì)胞名稱、代數(shù),、日期,。然后進(jìn)行凍存。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法,，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化.

如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過長,，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏,，在復(fù)溫時(shí),，大量水分會(huì)因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡,。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷,。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰,，產(chǎn)生冰晶損傷,。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑,，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷,。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn),，減少冰晶的形成,，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷,，細(xì)胞得以在很低溫條件下保存無血清快速細(xì)胞凍存液將加有凍存液的細(xì)胞混合液分裝至凍存管中;建議沒管1ml或1.5ml.上海無血清細(xì)胞凍存液使用方法

細(xì)胞凍存液配制主要成分.上海細(xì)胞凍存液一次加多少

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