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ChIP免疫沉淀磁珠現(xiàn)貨

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-06-28

免疫共沉淀分析(Co-IP)與IP十分類似,,基本的技術(shù)都是采用目標(biāo)抗原特異性的固相化抗體,;但I(xiàn)P的目標(biāo)是純化單一抗原,,而Co-IP旨在分離抗原及與抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)或配體。

在Co-IP實(shí)驗(yàn)中,,已知抗原稱為誘餌蛋白,,與之結(jié)合的蛋白則稱為靶蛋白。靶蛋白可能是一些復(fù)雜的伴侶蛋白,、信號(hào)分子,、結(jié)構(gòu)蛋白、輔助因子等,,蛋白間相互作用強(qiáng)度范圍可能介于高度瞬時(shí)和十分穩(wěn)定之間,。
基本的Co-IP實(shí)驗(yàn)方案與IP相同,實(shí)際上任何IP系統(tǒng)均可用于Co-IP。但是,,還有許多其他因素需要考慮,,例如,結(jié)合和洗滌條件的優(yōu)化,,優(yōu)化時(shí),,需要考慮到誘餌蛋白-靶蛋白的相互作用強(qiáng)度以及抗體-誘餌蛋白的親和力。
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免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法,。抗體與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后,,再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯(lián)的珠子(agarose或Sepharose)孵育,,通過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物,沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后,,重懸于電泳上樣緩沖液,,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,,抗原與抗體解離,,離心收集上清,上清中包括抗體,、目的蛋白和少量的雜蛋白,。免疫沉淀是一種生物學(xué)技術(shù),它利用抗體的特異性結(jié)合特性來(lái)富集和分離混合物中的特定蛋白質(zhì),。這種技術(shù)是研究蛋白質(zhì)表達(dá),、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)功能的強(qiáng)大工具,。蘇州ChIP免疫沉淀外包公司免疫沉淀技術(shù)RIP的實(shí)驗(yàn)方法,。

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    免疫沉淀(immunoprecipitation)是指利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性,將抗原(常為靶蛋白)從混合體系沉淀下來(lái),,初步分離靶蛋白的一種方法,。免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是一種在體外探測(cè)兩個(gè)蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理非常簡(jiǎn)單,,如果兩個(gè)蛋白在體外體系能夠發(fā)生特異性相互作用的話,,那么當(dāng)用一種蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí),另一個(gè)蛋白也會(huì)被同時(shí)沉淀下來(lái),。與酵母雙雜交技術(shù)不同,,免疫共沉淀技術(shù)所利用的是抗原和抗體間的免疫反應(yīng),是一種基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的方法,。

免疫沉淀技術(shù)RIP(RNA Immunoprecipitation,,RNA免疫沉淀)的實(shí)驗(yàn)方法基于以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟:
1. 細(xì)胞裂解:首先,,細(xì)胞或組織樣本被裂解,以釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和RNA復(fù)合物,。
2.抗體特異性結(jié)合:裂解后的樣本中加入針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白的抗體,。這些抗體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)蛋白。
3. 免疫復(fù)合物形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后,,形成抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物,。
4. 親和介質(zhì)捕獲:使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子(如瓊脂糖或磁性珠子)來(lái)捕獲這些抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合,,從而拉下與之結(jié)合的復(fù)合物,。
5. 洗滌:捕獲的復(fù)合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
6. RNA分離和分析:從珠子上洗脫或消化復(fù)合物,,分離出RNA,,并進(jìn)行進(jìn)一步的分析,如qPCR,、Northern blot或高通量測(cè)序(RNA-Seq),。
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免疫沉淀實(shí)驗(yàn)步驟:
1. 樣品制備
a. 懸浮細(xì)胞樣品處理:離心收集細(xì)胞(4℃, 1000g, 5 min),,用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液(裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail,,使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×),。混勻后置于冰上處理10 min,;離心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),,置于冰上備用(或置于-20℃長(zhǎng)期保存)。
b. 貼壁細(xì)胞樣品處理:移去培養(yǎng)基,,用PBS清洗細(xì)胞兩遍,;用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞,收集至1.5mL EP管內(nèi),,按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液(裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail,,使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×)。吹打數(shù)下,,使裂解液和細(xì)胞充分接觸,。混勻后置于冰上處理10 min,;離心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),,置于冰上備用(或置于-20℃長(zhǎng)期保存)。
4. 后續(xù):磁珠預(yù)處理——抗體吸附——抗原結(jié)合反應(yīng)——抗體洗脫
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免疫沉淀Co-IP技術(shù)選瓊脂糖珠還是磁珠,?ChIP免疫沉淀磁珠現(xiàn)貨

“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的結(jié)合蛋白,,進(jìn)行小規(guī)模的蛋白質(zhì)親和純化的實(shí)驗(yàn)。更確切地說(shuō),,IP是采用固定在微珠支持物(一般是瓊脂糖樹(shù)脂)上的特定抗體,,從復(fù)雜的混合物中,純化單一抗原的實(shí)驗(yàn),。固定化蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝既可以分步進(jìn)行,,也可以一步完成。

常見(jiàn)的加樣順序:抗體和樣本(如細(xì)胞裂解物)一起孵育,,然后加入親和微珠,,用于捕獲抗體-抗原復(fù)合物。也可以將抗體和微珠(通過(guò)抗體結(jié)合蛋白,,如蛋白A,、G或A/G等,直接或間接結(jié)合抗體)先進(jìn)行孵育,,然后再加入含有抗原的樣本,。當(dāng)抗原、抗體和固相支持物產(chǎn)生結(jié)合以后,,充分洗滌微珠,,再采用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液從支持物上洗脫抗原。
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標(biāo)簽: 免疫沉淀 支原體