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來源： 發(fā)布時(shí)間：2024-08-06

免疫沉淀技術(shù)在探索蛋白質(zhì)的功能方面猶如一把精密的鑰匙,，為我們開啟了深入理解生命奧秘的大門。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者,，其功能的實(shí)現(xiàn)往往依賴于與其他分子的相互作用,。免疫沉淀技術(shù)能夠特異性地捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì)及其相關(guān)復(fù)合物，從而為研究蛋白質(zhì)的功能提供直接的證據(jù),。通過對免疫沉淀得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,，可以了解蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、修飾狀態(tài)以及與其他蛋白質(zhì)或核酸的結(jié)合情況,。例如,，若要研究某一特定轉(zhuǎn)錄因子的功能，可以利用針對該轉(zhuǎn)錄因子的抗體進(jìn)行免疫沉淀,，然后檢測與其結(jié)合的DNA片段,，從而確定其調(diào)控的靶基因。此外,，免疫沉淀技術(shù)還可用于研究蛋白質(zhì)在不同生理或病理?xiàng)l件下的變化。比較正常細(xì)胞和病變細(xì)胞中特定蛋白質(zhì)的免疫沉淀結(jié)果,，能夠發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用的差異,，進(jìn)而揭示疾病發(fā)生的分子機(jī)制。在藥物研發(fā)中,，免疫沉淀技術(shù)也發(fā)揮著重要作用,。它可以幫助篩選與藥物靶點(diǎn)相互作用的蛋白質(zhì)，為藥物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供有價(jià)值的信息,。免疫沉淀技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法,。杭州Protein AG免疫沉淀磁珠多少錢

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免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵，因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否,。
1. 特異性：抗體應(yīng)當(dāng)對目標(biāo)蛋白具有高度的特異性,，以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽性結(jié)果,。
2. 親和力：抗體對目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高,，以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白,。
3. 抗體類型：單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性，而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋,。
4. 應(yīng)用驗(yàn)證：選擇已經(jīng)過驗(yàn)證的抗體,，這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息：選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商,，并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評價(jià),，以幫助做出決策。
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免疫沉淀實(shí)驗(yàn)不同于WB實(shí)驗(yàn)的樣品制備,，對實(shí)驗(yàn)樣品制備要求更高，除了要控制所有操作盡量在冰上完成外,，關(guān)鍵的是裂解液的成分,，裂解液成分直接決定了樣品質(zhì)量。
主要影響：
1. 蛋白的釋放：許多目的蛋白定位在細(xì)胞器,，質(zhì)膜,，細(xì)胞核，細(xì)胞骨架中,，但通常這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)很難被裂解液有效溶解,，所以很難將這些蛋白釋放出來。
2. 蛋白相互作用：不同去垢劑對不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)間相互作用影響程度不同,，一些互作較弱的蛋白對盡管在比較溫和的裂解液配方中仍然會(huì)被破壞,。

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ,，它能夠直接高效,、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備,。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結(jié)合載量,。
與瓊脂糖珠不同,，磁珠是固體，抗體的結(jié)合限于磁珠的表面,。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,，盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合,。
簡而言之，瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng)，而磁珠在得率,，可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢,。
免疫沉淀技術(shù)RIP的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？

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RIP實(shí)驗(yàn)步驟通常包括：
1. 細(xì)胞收集與交聯(lián)：培養(yǎng)細(xì)胞至適當(dāng)密度,。使用交聯(lián)劑（如甲醛）進(jìn)行交聯(lián),，以固定蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
2. 細(xì)胞裂解：收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解,，釋放RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,。在裂解過程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。
3. 超聲處理：使用超聲波破壞細(xì)胞,，獲得更小的染色質(zhì)片段,，這有助于后續(xù)步驟中抗體的接觸。
4. 除去細(xì)胞碎片：通過離心去除細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞,，收集含RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的上清液,。
5. 免疫沉淀：將針對特定RNA結(jié)合蛋白（RBP）的抗體加入到上清液中。孵育一段時(shí)間,，使抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合,。
6. 捕獲免疫復(fù)合物：添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的磁珠或瓊脂糖珠。孵育使抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物與珠子結(jié)合,。
7. 洗滌：多次洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA,。
8. 洗脫與逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫免疫復(fù)合物。使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián),，釋放RNA,。
9. RNA提取與純化：從免疫沉淀樣品中提取RNA，并進(jìn)行純化,。
10. RNA分析：使用qPCR,、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA,，以確定與目標(biāo)蛋白相互作用的RNA種類,。
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ChIP（染色質(zhì)免疫沉淀）實(shí)驗(yàn)是一種用于研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。以下是ChIP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法概述：
1. 交聯(lián)：將細(xì)胞與交聯(lián)劑（如1%甲醛）孵育,，通常在室溫下進(jìn)行10-15分鐘,。
2. 終止交聯(lián)：添加甘氨酸以終止交聯(lián)反應(yīng)，孵育5分鐘,。
3. 收集細(xì)胞：通過離心收集細(xì)胞,，并用PBS洗滌以去除交聯(lián)劑。
4. 細(xì)胞裂解：使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞,，釋放染色質(zhì),。
5. 染色質(zhì)剪切：使用超聲波或酶消化將染色質(zhì)剪切成適當(dāng)大小的片段,。
6. 免疫沉淀：將剪切后的染色質(zhì)與特異性抗體孵育，然后添加蛋白A/G磁珠,。
7. 洗滌：用低鹽,、高鹽和LiCl洗滌液洗滌磁珠，去除非特異性結(jié)合物,。
8. 洗脫：用洗脫緩沖液洗脫DNA,。
9. 逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：用蛋白酶K處理，然后在65°C下加熱過夜以逆轉(zhuǎn)交聯(lián),。
10. DNA純化：使用商業(yè)試劑盒或標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿方法純化DNA,。
11. 分析：使用qPCR分析富集的DNA，或進(jìn)行測序以確定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn),。
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標(biāo)簽： 免疫沉淀 支原體