鼠尾Ⅰ型膠原：材料與方法：1. 主要材料,、試劑和儀器鼠尾,、鹽酸、等滲氯化鈉溶液,、鈣液,、磷液均購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司。日立高新TEM HT770(日本日立公司),；多功能粉末X射線衍射儀,。2.酸解提取鼠尾Ⅰ型膠原蛋白取大鼠尾巴洗凈，用75%的乙醇浸泡5 min,。將尾巴剪開,，去掉皮毛，并剪成小段,，抽出銀色的肌腱,。將肌鍵剪斷置于平皿中，用無(wú)菌等滲氯化鈉溶液浸泡,。吸去等滲氯化鈉溶液,，將肌鍵置于平皿中剪碎，按每克肌鍵50 mL的比例加入0.1%的醋酸溶液,。搖晃,，將肌鍵分散于醋酸溶液中，4 ℃放置一周,，然后以2186×g離心20 min,。在醋酸溶液的酸解下，肌腱水解成膠凍狀凝膠,，置于冰箱4 ℃保存,。論鼠尾膠原能促進(jìn)毛細(xì)胞貼壁，涂布鼠尾膠原有利于膜片鉗實(shí)驗(yàn)的長(zhǎng)時(shí)程記錄,，并且制作簡(jiǎn)便,，成本低廉。一種基于鼠尾膠原蛋白：各材料重量配比為鼠尾膠原蛋白聚乙烯醇?xì)ぞ厶菫?% 2% 1%,，余量的水,。寧波正規(guī)鼠尾膠原廠家

鼠尾膠原蛋白：膠原蛋白（Collagen）是結(jié)締組織和內(nèi)臟部位外基質(zhì)的主要成分，但在皮膚,、肌腱,、骨骼中分布較為普遍,。膠原蛋白在結(jié)構(gòu)和遺傳學(xué)上被分為不同類型，I型膠原蛋白（Collagen, Type I）結(jié)構(gòu)上是由2個(gè)α1鏈和1個(gè)α2鏈組成的異源多聚體,，在37℃中性條件下可形成3股螺旋結(jié)構(gòu),，被普遍用于多種細(xì)胞的培養(yǎng)基質(zhì)，如肝細(xì)胞,、纖維細(xì)胞,、脊髓神經(jīng)節(jié)、雪旺氏細(xì)胞等,。另外,，I型膠原蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化,、遷移和組織形態(tài)的發(fā)生等方面也具有重要應(yīng)用,。膠原蛋白I（rat tail tendon collagen type I）根據(jù)Birkedal-Hansen方法，經(jīng)過(guò)醋酸（HAc）抽提,、氯化鈉沉淀,、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備所得，可用于制備三維膠,，模擬細(xì)胞真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境,；也可以用于包被組織培養(yǎng)皿表面，提高細(xì)胞表面粘附性,，比如培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞、肝細(xì)胞等原代細(xì)胞,。太原正規(guī)鼠尾膠原生產(chǎn)廠家膠原蛋白就像骨骼中的一張充滿小洞的網(wǎng),，它會(huì)牢牢地留住就要流失的鈣質(zhì)。

鼠尾膠原蛋白I型,，用那一種膠原酶可以溶解：1．將膠原加入到0.1M 的醋酸中,，制備成濃度為0.1%的溶液。在室溫中攪拌1-3小時(shí)直到完全溶解,。2．建議將溶液轉(zhuǎn)移到擰口的玻璃瓶中,，并小心的在瓶底鋪上一層氯仿。氯仿的量約為膠原溶液的10%,。不要晃動(dòng)或攪拌,。在2-8度中放置過(guò)夜。在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移上層的膠原溶液,。我們不建議用過(guò)濾的方法無(wú)菌化,。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該方法會(huì)導(dǎo)致丟失蛋白。3．稀釋一定數(shù)量的膠原溶液,。4．按照6-10ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶,。在室溫或37度結(jié)合數(shù)小時(shí)或者2-8度過(guò)夜,。5．從包被表面除去多余的液體。過(guò)夜干燥,。如果膠原溶液不是無(wú)菌的,，這時(shí)候可以在無(wú)菌細(xì)胞操作室中暴光在紫外線下過(guò)夜消毒。 在接種細(xì)胞前用無(wú)菌的水漂洗,。

三維膠原的制備：鼠尾膠原蛋白I型在濃度1mg/ml以上,，pH 7左右時(shí)可形成具有一定強(qiáng)度三維膠,建議成膠濃度1-2mg/ml。膠原蛋白溶解于0.006mol/L 乙酸中,，在成膠過(guò)程中需要加入0.06X 體積的 0.1mol/L NaOH 來(lái)中和,。需要的溶液 ( 均需要 無(wú)菌 、 預(yù)冷 ):10xPBS( 可含10 mg/L的酚紅用于 pH 指示 )或 10x 培養(yǎng)液 , 0.1mol/L NaOH, 0.1mol/L 乙酸(一般不用), 雙蒸水A．不含細(xì)胞的三維膠原的制備（以配制1毫升,，1mg/ml三維膠為例）：將200ul鼠尾膠原蛋白I型(5mg/ml)加到置于冰浴的離心管中,，加入690ul H2O。然后加到12ul 0.1mol/L NaOH中（如果反過(guò)來(lái)把12ul 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中,，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)）,，立即混勻。將鼠尾膠原加入到0.1M的醋酸中,，制備成濃度為0.1%的溶液,。

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：鼠尾膠原為底物的人鼻腔纖毛上皮細(xì)胞培養(yǎng)模式的建立目的建立以鼠尾膠原為貼附底物的人鼻腔纖毛上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式，為人鼻腔黏液纖毛運(yùn)輸系統(tǒng)的研究提供科學(xué)有效的方法.方法制備鼠尾膠原并鋪片,，以鼠尾膠原為貼附底物組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人鼻腔纖毛上皮細(xì)胞,，培養(yǎng)7天時(shí)進(jìn)行HE染色及掃描電鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，應(yīng)用高速攝像技術(shù)測(cè)量纖毛擺動(dòng)頻率.結(jié)果鼠尾膠原要平坦均勻,，平均厚度約為1mm,；HE染色可見上皮細(xì)胞呈單層向周圍爬開；掃描電鏡下見纖毛上皮細(xì)胞呈不規(guī)則多角形,，纖毛周圍可見微絨毛;透射電鏡下可見纖毛上皮細(xì)胞間為緊密連接,；同一細(xì)胞任意兩點(diǎn)纖毛擺動(dòng)頻率是相同的；同一來(lái)源體外培養(yǎng)的鉤突和下鼻甲的纖毛擺動(dòng)頻率是相同的.結(jié)論以鼠尾膠原為貼附底物人鼻腔纖毛上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式的成功建立,，為今后研究鼻內(nèi)用藥對(duì)纖毛清理功能的影響提供了良好的方法和途徑,。整個(gè)操作請(qǐng)?jiān)跓o(wú)菌環(huán)境下無(wú)菌操作，避免污染以影響細(xì)胞生長(zhǎng),。上海貴陽(yáng)鼠尾膠原

布鼠尾膠原有利于膜片鉗實(shí)驗(yàn)的長(zhǎng)時(shí)程記錄,。寧波正規(guī)鼠尾膠原廠家

鼠尾膠原蛋白Ⅰ型使用方法及注意事項(xiàng)：通過(guò)醋酸抽提、氯化鈉沉淀,、磷酸氫二鈉沉淀等 步驟制備的,。鼠尾膠原蛋白可用于包被細(xì)胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)一些在普通細(xì)胞 培養(yǎng)器皿中不易貼壁的細(xì)胞,。也可用于制備三維膠,，模擬真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境,， 使細(xì)胞在三維環(huán)境中生長(zhǎng)。 1,，在使用鼠膠原蛋白 型包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中檢查到PC-12 細(xì)胞的 貼壁和生長(zhǎng),。 1mg/ml濃度以上，pH 左右時(shí)可形成具有一定強(qiáng)度的三維膠,，檢查到 NIH-3T3 細(xì)胞在三維膠內(nèi)正常生長(zhǎng),、PC-12 細(xì)胞在三維膠表面 正常生長(zhǎng)。 使用方法： 1,、細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被 推薦濃度： 1-5ug/cm 0.012mg/ml,。按以下表格體積加到相應(yīng)的培養(yǎng)器皿中。寧波正規(guī)鼠尾膠原廠家