細胞轉染簡介：轉染，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入,，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導,、化學介導和生物介導三類途徑,。電穿孔法,、顯微注射和基因屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例,；化學介導方法很多，如經典的磷酸鈣共沉淀法,、脂質體轉染方法,、和多種陽離子物質介導的技術；生物介導方法,，有較為原始的原生質體轉染,，和現在比較多見的各種細菌介導的轉染技術。理想細胞轉染方法,，應該具有轉染效率高,、細胞毒性小等優(yōu)點。細菌介導的轉染技術,，是目前轉染效率較高的方法,，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是,，細菌轉染方法的準備程序復雜,，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及,。其它物理和化學介導的轉染方法,，則各有其特點,。轉染 ，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術,。石家莊細胞高效轉染試劑銷售廠家

細胞轉染實驗的方法有哪些：1..電穿孔法,。通過短暫的高電場電脈沖處理細胞，沿細胞膜的電壓差異會導致細胞膜的暫時穿孔,。DNA被認為是穿過孔擴散到細胞內的,。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞,。理論上說電穿孔法可用于各種細胞,，且不需要另外采購特殊試劑，但需要昂貴的電轉儀,。此法每次轉染需要更多的細胞和DNA,，因為細胞的死亡率高。每種細胞電轉的條件都需要進行多次優(yōu)化,。2.細菌介導的傳染,。傳染需要將目的基因克隆到特定的細菌體系中，經過包裝細胞的包裝得到改造后的細菌,，再進行傳染,。優(yōu)點是轉染效率特別高，尤其是難以轉染的原代細胞,、細胞,。缺點是構建細菌周期長，環(huán)節(jié)多,，易出錯,，費用也高石家莊細胞高效轉染試劑進貨價重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，較好在轉染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液,。

細胞轉染的注意事項：物品(PS)物品,，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉染的培養(yǎng)基添加物,。這些物品一般對于真核細胞無毒,，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使物品可以進入細胞,。這降低了細胞的活性,，導致轉染效率低。所以,，在轉染培養(yǎng)基中不能使用物品,，甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品。這樣，在轉染前也不必潤洗細胞,。對于穩(wěn)定轉染,，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，ICIN選擇性物品的競爭性克制劑,。另外,，為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量

細胞轉染常用步驟：1.轉染試劑的準備①將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘,，溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存,，使用前還需震蕩,。2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質體體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基,。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA,，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩,。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘,。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次,。5.加入混合液,，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。6.到時后,，根據細胞種類決定是否移除混合液,，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時必須通過對藥物的抗性篩選進行擴增或通過表型變化進行鑒定。

細胞轉染效率低下的幾個大坑：1.試劑過期有時候轉染效率低下,，還要考慮會不會存在試劑過期的情況,。毛博當年做轉染整整半年,，百思不得其解,。較后發(fā)現，原來是Lipofectamine2000過期了,。換了之后,，立馬成功。根據我的經驗,，盡量使用開封半年內的,，因為過了半年后，就算沒有過失效期,，但是細胞毒性較大增加,，而轉染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢，影響實驗進度哈,。2.未加血清轉染后未及時加入血清,，會導致細胞大量死亡。一般要在轉染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基,。根據毛博的經驗,，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候,，較好不要換液,，不要打擾細胞，讓它安安靜靜地休息,。但是也不能過早加入血清,。過早的話，會引起未轉染的細胞瘋狂生長,。那么,，什么是較佳時機呢？在20%的細胞變圓的時候,，就是加血清的較佳時機,。一般的瞬時轉染 方法多采用脂質體法。廈門細胞高效轉染試劑平均價格

大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內保持健康,。石家莊細胞高效轉染試劑銷售廠家

細胞轉染的注意事項：1.細胞鋪板密度用于轉染的較佳細胞密度根據不同的細胞類型或應用而異,。因轉染試劑對細胞有毒害作用，細胞太少,，容易死,。一般轉染時，貼壁細胞密度為70%-90%,，懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml,，確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉染效率對細胞密度很敏感,，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要,。鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白,。CMV啟動子在大多數細胞類型中可以獲得高表達活性,。同其他啟動子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比,，在BHK-21中其活性較高,。這三種細菌啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低,。轉染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細胞中CMV啟動子,，而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成,。石家莊細胞高效轉染試劑銷售廠家