三維膠原的制備：鼠尾膠原蛋白I型在濃度1mg/ml以上，pH7左右時可形成具有一定強(qiáng)度三維膠,建議成膠濃度1-2mg/ml,。膠原蛋白溶解于0.006mol/L乙酸中,，在成膠過程中需要加入0.06X體積的0.1mol/LNaOH來中和。需要的溶液(均需要無菌,、預(yù)冷):10xPBS(可含10mg/L的酚紅用于pH指示)或10x培養(yǎng)液,0.1mol/LNaOH,0.1mol/L乙酸(一般不用),雙蒸水A．不含細(xì)胞的三維膠原的制備（以配制1毫升,，1mg/ml三維膠為例）：將200ul鼠尾膠原蛋白I型(5mg/ml)加到置于冰浴的離心管中，加入690ulH2O,。然后加到12ul0.1mol/LNaOH中（如果反過來把12ul0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中,，會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻,。制備鼠尾膠原：離心,，4000轉(zhuǎn)/分，10-15分鐘,。唐山正規(guī)鼠尾膠原廠家批發(fā)價

鼠尾膠原蛋白Ⅰ型使用方法及注意事項：將培養(yǎng)器皿在室溫(25度左右)下放置20分鐘待膠凝固后,，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。如果配制中使用的是10PBS，使用前需要加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)平衡,。B．含細(xì)胞的三維膠原的制備（以配制200ul鼠尾膠原蛋白(5mg/ml)加到（如果反過來把12ul0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中,，會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻,。再加入23ul10PBS10培養(yǎng)液,，混勻(混勻后pH左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅,，初次使用時需要用pH試紙測試),。加入760ul的細(xì)胞懸浮液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中,。將培養(yǎng)器皿在室溫下放20分鐘待膠凝固后,，加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。注意事項型在室溫下pH中性時可迅速成膠,，在操作過程中要盡量保持低溫。鼠尾肌腱膠原蛋白I（rattailtendoncollagentypeI）根據(jù)Birkedal-Hansen方法,，經(jīng)過醋酸（HAc）抽提,、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備所得,。廈門武漢鼠尾膠原將無菌5cm左右的紗布海綿貼在150mm培養(yǎng)皿的蓋子上來制備氨蒸氣室,。

鼠尾膠原是一種天然培養(yǎng)基，它具有促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞（特別是上皮細(xì)胞）貼壁的作用,，同時它也是一種天然的黏附劑,，當(dāng)我們需要在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)放置小玻片，制備細(xì)胞爬片時,，可在瓶底涂一層膠原,，再放上小玻片，自然干燥后小玻片就固定于培養(yǎng)瓶之中,。通過本實驗可掌握鼠尾膠原的制備方法,，以及如何切割小玻片，并利用鼠尾膠原將其固定于培養(yǎng)瓶內(nèi),。實驗設(shè)備及材料：大鼠尾巴,、剪刀、鑷子,、止血鉗、彎頭吸管,、平皿,、三角燒瓶、燒杯、量筒,、天平,、生理鹽水、75%酒精,、0.1%醋酸溶液,、蓋玻片、培養(yǎng)瓶,、鉆石筆,、鼠尾膠原。實驗內(nèi)容：1,、制備鼠尾膠原,。2、切割小玻片,。3,、利用鼠尾膠原將小玻片固定于培養(yǎng)瓶內(nèi)。

鼠尾膠原是一種天然培養(yǎng)基和一種天然的黏附劑,，可用于細(xì)胞培養(yǎng)皿的包被,，特別適合普通細(xì)胞培養(yǎng)器皿不易貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)；也可用于制備三維膠原凝膠,，使細(xì)胞在模擬的三維環(huán)境中生長,。制備鼠尾膠原方法：1、取大鼠尾巴洗凈,，75%酒精浸泡5分鐘,；2、手持尾巴,，用止血鉗夾住鼠尾的較高,，折斷尾骨后拉出尾腱；3,、將尾腱剪斷置于平皿中,，生理鹽水浸泡；4,、重復(fù)步驟2,、3，直至尾腱量夠用,；5,、吸去生理鹽水，將尾腱稱重（0.5-1克）,；6,、將尾腱置于平皿內(nèi)剪碎,，轉(zhuǎn)移至三角燒瓶中；7,、按每克尾腱50ml的比例,，加入0.1%醋酸溶液；8,、搖晃,，使尾腱分散于醋酸溶液中，4℃放置一星期,；9,、離心，4000轉(zhuǎn)/分,，10-15分鐘,；10、吸取上清,，分裝成小瓶,，4℃保存。鼠尾膠原蛋白的用途是什么：顧名思義,，鼠尾膠原蛋白是從老鼠尾巴提取出來的物質(zhì),。

詳細(xì)步驟如下：1.75％酒精浸泡大鼠尾巴30min；2.將尾巴剪開,、去掉皮毛,，并剪成小段（3cm左右），抽出銀色的尾鍵,；3.把剪碎的尾鍵置于150ml,，0.1％消過毒的醋酸中，4℃放置,，并不時振蕩,；4.48h后取上清，4000轉(zhuǎn)離心30min后,，取上清,；5.分裝上清（鼠尾膠）4度（或-20度）保存。有時可繼續(xù)向4,。中沉淀中加入10－20ml醋酸,，重復(fù)以上步驟，以制備更多的鼠尾膠,。在使用時,，先將冰存的膠原液在室溫下解凍，再按以下步驟包被培養(yǎng)器皿：1）用吸管吸取膠原液,，在無菌的培養(yǎng)器皿的生長面內(nèi)壁上均勻地涂上薄薄的一層膠原溶液,。2）若包被的是培養(yǎng)瓶,，可向培養(yǎng)瓶通入氨氣或用浸有氨水的棉球封口片刻。讓氨氣充入瓶內(nèi)后,，即可旋緊瓶蓋或塞緊瓶塞。若為培養(yǎng)皿或板的話,，可將培養(yǎng)皿或板放在已消毒的飯盒內(nèi),，將浸有氨水的棉球放入飯盒內(nèi)，蓋緊飯盒蓋,，四周用封口膠封死,。細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被以包被濃度為2μg/cm2為例。南京太原鼠尾膠原

期間不斷攪拌,，防止凍結(jié)成塊,，得到膠原溶脹液。唐山正規(guī)鼠尾膠原廠家批發(fā)價

鼠尾膠原膠凝程序：膠原蛋白I按以下步驟使其pH達(dá)到堿性時凝膠,。1）將無菌5cm左右的紗布海綿貼在150mm培養(yǎng)皿的蓋子上來制備氨蒸氣室,。用氫氧化銨使紗布飽和，把蓋子放在150mm的培養(yǎng)皿上,，暫放置一邊,。2）將膠原蛋白I均勻涂布在要包被物的表面上，厚度可以根據(jù)需要改變,，膠原蛋白I（50-100μL）足以涂覆22mm的蓋玻片,。對于直徑100mm的培養(yǎng)皿，每個加入約6mL;對于60mm培養(yǎng)皿添加約2.3mL,，對于35mm培養(yǎng)皿添加約1mL,。3）將涂有膠原蛋白的蓋玻片或帶有蓋子的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到氨蒸氣室并暴露三分鐘。4）在無菌蒸餾水中（35mm培養(yǎng)皿加5mL,，60mm培養(yǎng)皿加10mL等）浸泡涂布的蓋玻片或培養(yǎng)皿30min,。吸取原蒸餾水并加0.5-1.0mL無菌蒸餾水，放置在層流罩中過夜,。5）吸出蒸餾水,，用含血清的平衡鹽緩沖液溶液代替并保存在2-8°C。唐山正規(guī)鼠尾膠原廠家批發(fā)價