原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系細(xì)胞的來源多樣，培養(yǎng)方法也各不相同，凡是來源于胚胎,、組織部位及外周血,，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞經(jīng)分散接種之手段稱為傳代,。凡能經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。若能穩(wěn)定生長傳至10~20代以上的細(xì)胞可確立為細(xì)胞系。若有條件能開展單細(xì)胞克隆,、純化，經(jīng)大量擴(kuò)增后所形成的生物學(xué)特性穩(wěn)定的克隆化細(xì)胞群,，稱之為細(xì)胞株或克隆細(xì)胞,。此過程稱為細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)，只有熟悉和掌握了基本技術(shù),才可能更快捷地學(xué)習(xí)和掌握其他方法,本章重點(diǎn)敘述常用的基本技術(shù),?？壳肮?jié)原代細(xì)胞的取材人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的靠前步,，若取材不當(dāng),，將會直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)原代細(xì)胞是出了名的難養(yǎng)，對培養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)操作的要求更苛刻,。貴陽正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒廠家供應(yīng)

原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法：1.當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90%融合時(shí)需要傳代培養(yǎng),。2.提前準(zhǔn)備好多聚賴氨酸（PLL，貨號0403）或纖維粘連蛋白（BPF,，貨號8248）包被好的培養(yǎng)瓶,。3.將完全培養(yǎng)基，胰酶/EDTA消化液（T/E,，貨號0103）,，胰胰中和液（TNS，貨號0113）和不含鈣鎂離子的DPBS（貨號0303）加熱至室溫,。我們不推薦用37度水浴加熱試劑和培養(yǎng)基,。4.用DPBS沖洗細(xì)胞。5.以T-75培養(yǎng)瓶為例,，向培養(yǎng)瓶中加入8mlDPBS,，然后加入2ml胰酶/EDTA消化液。輕輕搖動培養(yǎng)瓶保證細(xì)胞被胰酶/EDTA消化液完全覆蓋,。將培養(yǎng)瓶置于37度培養(yǎng)箱1-2分鐘直到細(xì)胞變圓,。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。6.在消化期間,，準(zhǔn)備一支50ml離心管加入5ml胎牛血清（FBS,，貨號0500）。廣州原代細(xì)胞分離試劑盒報(bào)價(jià)較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng),，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì),。

細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)及常見問題解答：傳代1、貼壁細(xì)胞傳代時(shí),，先用消化液潤洗一遍,；棄掉后，再加入適量消化液置于孵箱或鏡下觀察消化,；當(dāng)細(xì)胞變圓,，彼此之間產(chǎn)生空隙，加入等量或大量的培養(yǎng)基終止消化,，培養(yǎng)基中的血清可以克制胰蛋白酶的活性,。2,、這里我沒有明確提到胰蛋白酶的濃度，并不是說濃度越高越好,。胰蛋白酶底物的特異性差,，會破壞細(xì)胞膜成分。PH8.0,，37度環(huán)境下,，消化液的消化能力是較強(qiáng)的。培養(yǎng)基中的血清會降低胰酶的消化能力,，所以每次消化前,，也要用PBS反復(fù)沖洗干凈培養(yǎng)皿。日常用的比較多的消化液濃度：a)0.25%胰蛋白+0.02%EDTA,。

原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)：轉(zhuǎn)染過程不可添加物品,，否則會導(dǎo)致細(xì)胞死亡；開始實(shí)驗(yàn)siRNA的用量設(shè)置在終濃度10nM,、30nM,、50nM、100nM進(jìn)行摸索,，后續(xù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果修改,。RFectPM可用來轉(zhuǎn)染siRNA、antisenseRNA,、microRNA等200bp以內(nèi)的小分子RNA和DNA,，可轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細(xì)胞。對于大多數(shù)原代細(xì)胞,，RFectPM的細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽性率都在80%以上,，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率不到10%,。RFectPM的使用也極其簡便,，先將sRNA與RFectPM室溫混合，再將siRNA-RFectPM混合物直接加入含培養(yǎng)基的細(xì)胞,，血清對轉(zhuǎn)染效果沒有影響,，不必刻意添加或更換培養(yǎng)液。必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài),?？梢酝ㄟ^增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。

原代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：1.收到細(xì)胞時(shí),，要鏡下觀察是否有污染情況,；收到細(xì)胞的前幾天，要做好各種倍數(shù)的鏡下拍照記錄,，以防細(xì)胞出現(xiàn)問題后,，可以跟公司很好地溝通,。2.收到細(xì)胞后，不要馬上處理,。應(yīng)置于培養(yǎng)箱中靜置4h以上再操作,。如果不著急，可靜置過夜,。3.細(xì)胞的靠前次傳代,，一定要密度高一些傳代，原代細(xì)胞傳代密度低,，很難長起來,。建議1:2-1:3傳代。4.原代細(xì)胞傳代時(shí)（內(nèi)皮細(xì)胞,，貼壁為例）,，0.25%+0.53nM的胰酶消化，1ml消化液37度培養(yǎng)箱內(nèi)消化30sec,，再加入5ml培養(yǎng)基（正常消化貼壁細(xì)胞,，我們使用胰酶和培養(yǎng)基的量是1:1，但是原代細(xì)胞必須用大量培養(yǎng)基中和胰酶）,。5.原代細(xì)胞不建議凍存,，因?yàn)閮龃婧苋菀讖?fù)活不成功。如果要凍存的話,，建議在P2或P3代凍存,，凍存液中的血清越多越好，建議比例9（血清）:1（DMSO）,。6.原代細(xì)胞復(fù)蘇時(shí),，置于37-38度水浴融化細(xì)胞，并加入10ml培養(yǎng)液（正常貼壁細(xì)胞復(fù)蘇時(shí),，也可以使用這種比例,，復(fù)蘇成活率會較大提高），離心重懸鋪板用70％的酒精沖洗凍存管,，然后擦去多余酒精,。貴陽正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒廠家供應(yīng)

原代細(xì)胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用，市場前景廣闊,。貴陽正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒廠家供應(yīng)

細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)及常見問題解答：1,、培養(yǎng)基的選擇依細(xì)胞種類而定。如果是從別的實(shí)驗(yàn)室借來的細(xì)胞,，較初階段一定要保持細(xì)胞原有的培養(yǎng)條件,；特殊種類的細(xì)胞，比如內(nèi)皮細(xì)胞,，可以借鑒網(wǎng)上培養(yǎng)成功的條件,，添加一些特定成分,。2、液體培養(yǎng)基的保存條件應(yīng)是冰箱4度冷藏,。小六兒見過有的大實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞量多,，一次性購買的培養(yǎng)基瓶數(shù)也多，有些人可能覺得-20冰箱保存時(shí)間會更久一些,。但是經(jīng)過冷凍后的培養(yǎng)基再溶化時(shí),，你會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化，顏色變深,，這就是培養(yǎng)基的PH值升高了,。3、培養(yǎng)基中都含有大量的谷氨酰胺,，用來合成細(xì)胞生長所需要的核酸和蛋白質(zhì),。但是谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，保存4周后的培養(yǎng)基需要重新加入谷氨酰胺,。所以盡量不要大批量購買培養(yǎng),，也不要一次配太多的培養(yǎng)基貴陽正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒廠家供應(yīng)