細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些：1..電穿孔法。通過短暫的高電場電脈沖處理細(xì)胞,，沿細(xì)胞膜的電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的暫時(shí)穿孔。DNA被認(rèn)為是穿過孔擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的,。電脈沖和場強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^高的場強(qiáng)和過長的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞,。理論上說電穿孔法可用于各種細(xì)胞,，且不需要另外采購特殊試劑,，但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀。此法每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA,，因?yàn)榧?xì)胞的死亡率高,。每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化。2.細(xì)菌介導(dǎo)的傳染,。傳染需要將目的基因克隆到特定的細(xì)菌體系中,，經(jīng)過包裝細(xì)胞的包裝得到改造后的細(xì)菌，再進(jìn)行傳染,。優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率特別高,，尤其是難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、細(xì)胞,。缺點(diǎn)是構(gòu)建細(xì)菌周期長,，環(huán)節(jié)多，易出錯(cuò),，費(fèi)用也高蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的,。青島正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑：1.不注意細(xì)節(jié)在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基,，可提高轉(zhuǎn)染效率,。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應(yīng)當(dāng)一滴一滴地滴下來，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊,，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿,，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細(xì)枝末節(jié),，但是,，如果不注意的話，也會(huì)造成轉(zhuǎn)染效率低下,。2.細(xì)胞狀態(tài)不好細(xì)胞狀態(tài)不好,，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。一般進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長期,。如果是貼壁細(xì)胞的話,，貼壁率應(yīng)該在70-80%；如果是懸浮細(xì)胞的話,，應(yīng)該是6X105個(gè)/孔（24孔板）,，一般是轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在換液，轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次,。轉(zhuǎn)染的整個(gè)過程都不應(yīng)該有物品,。廣州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí),。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡介：實(shí)驗(yàn)原理外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法,、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和細(xì)菌介導(dǎo)法,。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入;磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞;細(xì)菌法是利用包裝了外源基因的細(xì)菌傳染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán),、難度較大;細(xì)菌法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜,、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響;所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法~

細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒：1.設(shè)置陰性和陽性對(duì)照：一般在轉(zhuǎn)染后24-48h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),?？梢罁?jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測等實(shí)驗(yàn)。2.轉(zhuǎn)染后效率的檢測方法：觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況,；qPCR驗(yàn)證,；WB檢測敲減或過表達(dá)蛋白。3.轉(zhuǎn)染效率低,，可采取以下兩種方法：1)復(fù)轉(zhuǎn)染,，即轉(zhuǎn)染后12-24h再進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前提是該細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的耐受性較好,，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少,。2)通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞，前提是該質(zhì)粒帶有物品抗性的基因,。4.電轉(zhuǎn)時(shí),，不同的細(xì)胞需要的電壓是不一樣的，需要做預(yù)實(shí)驗(yàn),，摸索較佳條件,。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞而言，較佳電壓位于250-1250v/cm,。電擊后,，應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10min,使細(xì)胞恢復(fù)損傷。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡介實(shí)驗(yàn)步驟：1,、細(xì)胞傳代(1)試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球,，廢液缸,，試管架，微量移液器,，記號(hào)筆,，培養(yǎng)皿，離心管,。(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液,，消化1分鐘(37,。C,，5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來為止,。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。(5)用頭多次吹吸,，使細(xì)胞完全分散開,。(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min,。(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中,，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中,，使其均勻分布。(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，第二天轉(zhuǎn)染,。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,，用胰酶處理為單細(xì)胞懸液,。蕪湖唐山細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

操作簡便，對(duì)細(xì)胞毒性小,，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞,。青島正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家

轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：用于蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。但更傾向于使用無血清培養(yǎng)基表達(dá)蛋白,，因?yàn)檠宓鞍讜?huì)干擾下游表達(dá)蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對(duì)某一特定細(xì)胞類型優(yōu)化并有幾類無血清培養(yǎng)基不需要添加血清,，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培養(yǎng)基低得多）,。無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物，限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分,。多種多樣的配方使您可以選擇較適合您應(yīng)用的一種,。在含血清時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，無蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基,。在部分情況下（如293-F,，293-H，COS-7和CHO-S）,，對(duì)于已適應(yīng)無血清或無蛋白培養(yǎng)基的細(xì)胞,，可以使用其培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其他一些無血清培養(yǎng)基包含克制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的成分,，在這些情況下,，有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染,。青島正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家

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