細胞轉(zhuǎn)染實驗注意事項：1.培養(yǎng)基中的物品物品是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,，使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,，導致轉(zhuǎn)染效率降低,。這時候可以選擇Entranster轉(zhuǎn)染試劑，非脂質(zhì)體試劑,，培養(yǎng)基可加物品,，避免了細胞染菌。2.設置陽性對照和陰性對照,。3.一般在轉(zhuǎn)染24-48h,，靶基因即在細胞內(nèi)表達。根據(jù)不同的實驗目的,，24-48h后即可進行靶基因表達的檢測實驗,。4.如若建立穩(wěn)定的細胞系，則可對靶細胞進行篩選,，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物,，常用的真核表達基因載體的標志物有潮霉素和新霉素等。細胞轉(zhuǎn)染是完成這一過程的必需步驟,。濟南細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家

細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.準備不足做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的時候,，在開展正式實驗前要多做預試驗，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：脂質(zhì)體的用量,、DNA密度、細胞密度,、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間等等,。2.電壓過大做電轉(zhuǎn)的時候，如果電壓太大,，往往會發(fā)生細胞大量死亡的情況,。不同的細胞，需要的電壓是不一樣的,。這就要求我們多做預實驗,，多摸索條件,。對于大多數(shù)細胞來說，其較佳電壓位于250-1250v/cm,。另外,，就是進行轉(zhuǎn)染的細胞應該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細胞的抗損傷能力是較強的,。細胞濃度應該處于5x106到1x107／mL之間,。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應該控制在4-6μg，如果﹥10μg,，轉(zhuǎn)染效率也較大降低,。電擊后，應該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10分鐘,，使細胞恢復損傷,。細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中。

細胞轉(zhuǎn)染操作方法：轉(zhuǎn)染,，是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術,。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法,。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導,、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法,、顯微注射和基因?qū)儆谕ㄟ^物理方法將基因?qū)爰毎姆独?；化學介導方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法,、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術；生物介導方法,，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,，和現(xiàn)在比較多見的各種細菌介導的轉(zhuǎn)染技術。理想細胞轉(zhuǎn)染方法,，應該具有轉(zhuǎn)染效率高,、細胞毒性小等優(yōu)點。細菌介導的轉(zhuǎn)染技術,，是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法,，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是,，細菌轉(zhuǎn)染方法的準備程序復雜,，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及,。

轉(zhuǎn)染的注意事項：細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應用而異,。一般轉(zhuǎn)染時,，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2×106-4×106細胞/ml時效果較好,。確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期,。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感,，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要,。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。在三種不同密度進行細胞鋪板的比較表明鋪板密度較高的,，CAT活性也較高,。得到較高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應增加了。這些結果說明,，對于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會因細胞密度而異,。可以使用一些營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基,，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清,。

細胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清：不同的細胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同的。較好是在靠前次實驗前做一個預實驗,，比如：HeLa,，293，CHO,，COS7,，MCF－7，HepG2等細胞,，是否加血清,，對不同的細胞是有不同的影響的，有些細胞是可以有血清的,，有些加血清就會受影響,。轉(zhuǎn)染后在6小時左右較好換液且換為有血清的培養(yǎng)基，其一因為普通轉(zhuǎn)染試劑對細胞的毒性作用大,，其二可降低因血清的缺乏引起的細胞的死亡,。轉(zhuǎn)染時不加血清是防止血清的干擾作用，轉(zhuǎn)染后可適時加入,。加入過早會引起未轉(zhuǎn)染細胞的優(yōu)勢生長,，過晚會引起較多細胞死亡?？蓪崟r觀察1/5細胞變圓的時候加入血清,。通過緩沖液的作用以及脂質(zhì)與內(nèi)體膜融合，增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓,。武漢細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應

重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,，較好在轉(zhuǎn)染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液,。濟南細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家

細胞轉(zhuǎn)染實驗簡介：實驗材料與器材：1、材料293T細胞,、MyoD表達質(zhì)粒和EGFP表達質(zhì)粒,、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素(雙抗),、FCS(小牛血清),、PBS(磷酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA消化液,、轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)2,、器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸,、血球計數(shù)板,、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱,、臺式離心機,、35mm培養(yǎng)皿、轉(zhuǎn)染管,、15ml離心管,、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法較重要的就是防止其毒性,，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,，細胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用,。濟南細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家