細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異,。因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，細(xì)胞太少,，容易死,。一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml,，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長(zhǎng)滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感,，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要,。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做啟動(dòng)子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白,。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性,。同其他啟動(dòng)子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細(xì)菌)相比,，在BHK-21中其活性較高,。這三種細(xì)菌啟動(dòng)子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低,。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動(dòng)Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子,，而單PMA就足以啟動(dòng)KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時(shí)會(huì)提高,，因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成,。當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)，通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞,。廣州正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價(jià)格

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法：磷酸鈣共沉淀原理：該法可用于瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,。然而因其對(duì)pH、溫度和緩沖液鹽濃度的微小變化十分敏感,，所得結(jié)果容易出現(xiàn)差異,，且對(duì)許多類型的細(xì)胞培養(yǎng)物(尤其是原代細(xì)胞)具有細(xì)胞毒性，轉(zhuǎn)染效率較差,。實(shí)驗(yàn)步驟：將核酸與氯化鈣在磷酸鹽緩沖液中混合,，同時(shí)控制好pH、溫度等條件 → 室溫孵育，生成濃縮DNA的極小不溶性顆粒沉淀 → 將顆粒型沉淀分散到細(xì)胞中,，促進(jìn)DNA粘附在細(xì)胞表面 → 共沉淀通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿 → 分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或者選擇穩(wěn)定性傳染,。細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（很長(zhǎng)轉(zhuǎn)染）,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù),。分為物理介導(dǎo)方法：電穿孔法、顯微注射和基因,；化學(xué)介導(dǎo)方法：如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法,、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù),；生物介導(dǎo)方法：有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,，和現(xiàn)在比較多見的各種細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn),。細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),，是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì),。但是細(xì)菌轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及,。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,，則各有其特點(diǎn)。需要指出的一點(diǎn),，無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù),，要獲得較優(yōu)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，可能都需要對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化,。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多,，從細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)到轉(zhuǎn)染方法的操作細(xì)節(jié),。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑：1.準(zhǔn)備不足做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的時(shí)候,，在開展正式實(shí)驗(yàn)前要多做預(yù)試驗(yàn)，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：脂質(zhì)體的用量,、DNA密度、細(xì)胞密度,、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時(shí)間等等,。2.電壓過大做電轉(zhuǎn)的時(shí)候，如果電壓太大,，往往會(huì)發(fā)生細(xì)胞大量死亡的情況,。不同的細(xì)胞,，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預(yù)實(shí)驗(yàn),，多摸索條件,。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來說，其較佳電壓位于250-1250v/cm,。另外,，就是進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞的抗損傷能力是較強(qiáng)的,。細(xì)胞濃度應(yīng)該處于5x106到1x107／mL之間,。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應(yīng)該控制在4-6 μg，如果﹥10μg,，轉(zhuǎn)染效率也較大降低,。電擊后，應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10分鐘,，使細(xì)胞恢復(fù)損傷,。由于脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過24小時(shí),。

轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)DNA轉(zhuǎn)染后,，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1－4天內(nèi)檢測(cè)到。*有一部分轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并較終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成,。幾天內(nèi),，大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋；一周后就檢測(cè)不到其存在了,。瞬時(shí)表達(dá)分析檢測(cè)未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達(dá),。因此，表達(dá)水平與位臵無關(guān),，不會(huì)受到周圍染色體元件的影響,。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少，但因?yàn)镈NA攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大,，實(shí)驗(yàn)必須很小心,。為了進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)入的基因必須能和細(xì)胞同步復(fù)制,。在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒自發(fā)整合到宿主基因組上時(shí)就會(huì)如此,。在一小部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，加入的DNA通過重組整合到基因組上,。包含整合DNA的細(xì)胞很少,，必須通過對(duì)藥物的抗性篩選進(jìn)行擴(kuò)增或通過表型變化進(jìn)行鑒定。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，外源基因得以表達(dá)但它們并不會(huì)整合到細(xì)胞的基因組中,。徐州唐山細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后,，可在48h-72h細(xì)胞長(zhǎng)滿之后，提取細(xì)胞蛋白或者RNA,。廣州正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價(jià)格

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測(cè)：基因的瞬時(shí)表達(dá)在24-72小時(shí)內(nèi)就結(jié)束了,。這種快速的瞬時(shí)表達(dá)非常適用于驗(yàn)證質(zhì)粒表達(dá)和監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染步驟的效率?？梢允褂脠?bào)告基因來確定優(yōu)化條件,，其表達(dá)蛋白易檢測(cè)，在目的細(xì)胞中不含此蛋白或水平很低,。常用的報(bào)告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）,，綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b- 半乳糖苷酶（b-gal）,?？梢允褂煤?jiǎn)單的非同位素方法檢測(cè)b-gal的表達(dá)以測(cè)定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMV SPORT- bgal質(zhì)粒包含CMV啟動(dòng)子調(diào)控下的LacZ基因,，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞內(nèi)后可以直接表達(dá)bgal,。結(jié)合簡(jiǎn)單的檢測(cè)步驟,，可以做為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法,。廣州正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價(jià)格