細(xì)胞轉(zhuǎn)染那些事兒：1.設(shè)置陰性和陽性對照：一般在轉(zhuǎn)染后24-48h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?？梢罁?jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測等實(shí)驗(yàn),。2.轉(zhuǎn)染后效率的檢測方法：觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況；qPCR驗(yàn)證,；WB檢測敲減或過表達(dá)蛋白,。3.轉(zhuǎn)染效率低，可采取以下兩種方法：1)復(fù)轉(zhuǎn)染,，即轉(zhuǎn)染后12-24h再進(jìn)行轉(zhuǎn)染,，前提是該細(xì)胞對脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少,。2)通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞,，前提是該質(zhì)粒帶有物品抗性的基因。4.電轉(zhuǎn)時,，不同的細(xì)胞需要的電壓是不一樣的,，需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索較佳條件,。對于大多數(shù)細(xì)胞而言,，較佳電壓位于250-1250v/cm。電擊后,，應(yīng)該將DNA和細(xì)胞混合液在室溫下放置10min,使細(xì)胞恢復(fù)損傷,。是目前實(shí)驗(yàn)室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高,，優(yōu)于磷酸鈣法,。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡介實(shí)驗(yàn)步驟：1、細(xì)胞傳代(1)試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),，酒精棉球,，廢液缸，試管架,，微量移液器,，記號筆,，培養(yǎng)皿，離心管,。(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液,，消化1分鐘(37,。C，5%CO2),。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來為止。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng),。(5)用頭多次吹吸,，使細(xì)胞完全分散開。(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中,，1000rpm離心5min,。(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個細(xì)胞加入一個35mm培養(yǎng)皿,。(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中,，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布,。(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，第二天轉(zhuǎn)染。蕪湖開封細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘,，溶解脂狀物。

影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的因素：1.轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系不匹配轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系也是講究配合默契的,，使用同一種試劑,，不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同。但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要,，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑,。每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過這些資料可選擇較適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑,。當(dāng)然,，較適合的是高效、低毒,、方便,、廉價的轉(zhuǎn)染試劑。因?yàn)橛行┘?xì)胞系是不穩(wěn)定的,，可能隨著培養(yǎng)時間的改變,，培養(yǎng)條件的不同,，不同的選擇壓力，可能引起不同的克隆選擇,。因此就算是同一個細(xì)胞系,，在不同條件下轉(zhuǎn)染能力的差異可能會很大。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.不注意細(xì)節(jié)在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基,，可提高轉(zhuǎn)染效率,。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應(yīng)當(dāng)一滴一滴地滴下來，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊,，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿,，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細(xì)枝末節(jié),，但是,，如果不注意的話,，也會造成轉(zhuǎn)染效率低下,。2.細(xì)胞狀態(tài)不好細(xì)胞狀態(tài)不好，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下,。一般進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期,。如果是貼壁細(xì)胞的話，貼壁率應(yīng)該在70-80%,；如果是懸浮細(xì)胞的話,，應(yīng)該是6X105個/孔（24孔板），一般是轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在換液,，轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次,。轉(zhuǎn)染的整個過程都不應(yīng)該有物品。在瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中往往都含有一個報告基,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：物品(PS)物品,，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物,。這些物品一般對于真核細(xì)胞無毒,，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使物品可以進(jìn)入細(xì)胞,。這降低了細(xì)胞的活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時也要避免使用物品。這樣,，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞,。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，ICIN選擇性物品的競爭性克制劑,。另外,，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量轉(zhuǎn)染 ,，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù),。開封細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑價格

較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對數(shù)生長期的細(xì)胞。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家

影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的因素：細(xì)胞狀態(tài)變化：（1）轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配細(xì)胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細(xì)胞,，也不是傳代很多次的細(xì)胞,。這是因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化,。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛,，較容易轉(zhuǎn)染,。（2）把握時機(jī)沒錯！轉(zhuǎn)染也有適當(dāng)?shù)臅r機(jī),，相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA,。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在種板,。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài),，如細(xì)胞數(shù)量過多，互相疊加,，營養(yǎng)物質(zhì)耗竭,，代謝廢物積聚，轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的,！杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家