細(xì)胞凍存經(jīng)驗(yàn)談:選對凍存培養(yǎng)基才是王道：研究人員經(jīng)常需要冷凍細(xì)胞并保存,，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)或臨床使用,。基本過程相當(dāng)簡單：慢慢冷凍細(xì)胞,，將凍存管放入液氮中,，并在需要時(shí)快速解凍,。凍存培養(yǎng)基能支持細(xì)胞并防止冰晶形成。不過,，Malfavon的體驗(yàn)告訴我們,，使用不同的凍存培養(yǎng)基，結(jié)果那可是大不同,。一些經(jīng)驗(yàn)老道的研究人員自己制備凍存培養(yǎng)基,。不過，那些面對脆弱細(xì)胞（比如原代和多能細(xì)胞）的研究人員，則更喜歡購買標(biāo)準(zhǔn)化的商業(yè)產(chǎn)品,。一些非常敏感的細(xì)胞系也許能從添加物中受益,，以避免細(xì)胞在解凍時(shí)凋亡。PH,，電解質(zhì)等的改變,，進(jìn)而促使細(xì)胞死亡。上海長沙無血清細(xì)胞凍存液

細(xì)胞凍存,，我們應(yīng)該注意哪些事項(xiàng)：1,、凍存細(xì)胞是為了留種，所以要選擇高濃度的細(xì)胞量進(jìn)行凍存,。正常情況下,，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到1*105/ml時(shí)即可凍存，具體是多少量主要根據(jù)個(gè)人觀察,。2,、二甲基亞砜（DMSO)因?yàn)榇┩讣?xì)胞的能力較強(qiáng)，因此作為常用的凍存劑,，也可以叫做細(xì)胞保護(hù)劑加入到細(xì)胞懸液中,。網(wǎng)上有些分享說道，如果選用DMSO,，整個(gè)細(xì)胞懸液的制作過程都要在4℃環(huán)境下進(jìn)行,。本人采用過這種方法凍存過A549和某一原代細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)A549復(fù)蘇存活率和正常凍存的過程相比并沒有明顯區(qū)別,，而原代細(xì)胞的接種率確實(shí)有所上升,，可能是因?yàn)槭茿549細(xì)胞比較皮實(shí)，這種方法更適用于比較脆弱的細(xì)胞吧,。成都正規(guī)無血清細(xì)胞凍存液廠家鏡檢后,，研究者可根據(jù)各自方法和需要來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存液的操作步驟：1.配置含10%DMSO或凡士林,、10～20%小牛血清的凍存細(xì)胞培養(yǎng)液;2.取對數(shù)成長期的體細(xì)胞,，除去舊細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清理,。3.除去PBS,，添加適量蛋白酶(遮蓋細(xì)胞培養(yǎng)皿表層)把單面生長發(fā)育的體細(xì)胞消化吸收出來;4.抽濾1000rpm，5min;5.除去蛋白酶,，添加適量配置好的凍存細(xì)胞培養(yǎng)液,，用塑料吸管輕輕地吹打使體細(xì)胞勻稱，記數(shù),，調(diào)整凍存液中體細(xì)胞的較后相對密度為5牙周106/ml～1牙周107/ml;6.將體細(xì)胞分裝進(jìn)凍存管中,，每管1～1.5ml;7.在凍存管上標(biāo)出體細(xì)胞的名字,，凍存時(shí)間及作業(yè)者;8.凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序流程為減溫速度-1～-2℃/min;當(dāng)溫度達(dá)-25℃下列時(shí)，可升至-5℃～-10℃/min;到-100℃時(shí),，則可快速滲入液態(tài)氮中,。也可將配有體細(xì)胞的凍存管放進(jìn)-20℃電冰箱2h，隨后放進(jìn)-70℃電冰箱中留宿,，取下凍存管,，移進(jìn)液氮容器內(nèi)。

無血清快速細(xì)胞凍存液細(xì)胞冷凍保存方法：選擇凍存處于對數(shù)生長期的細(xì)胞有助于提高復(fù)蘇細(xì)胞存活率,。1.按照常用方法收集懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞于試管中,。2.按照培養(yǎng)細(xì)胞密度和所用細(xì)胞凍存管的尺寸計(jì)算所需凍存細(xì)胞數(shù)。（參考：5×105至5×106cells/ml）,。3.取相當(dāng)于所需細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸浮液量,，置于離心管中，離心收集培養(yǎng)細(xì)胞（參考離心條件：1,000~2,000rpm,，4℃,，3~5min）。移去離心管中的上清液,。4.加入適量的無血清型細(xì)胞凍存液于離心管中,，使細(xì)胞濃度為5×105至5×106cells/ml。緩慢地混合均勻,，制成細(xì)胞混合液,。5.將離心管中的細(xì)胞混合液分裝于已標(biāo)示完全的冷凍保存管中。6.直接將含細(xì)胞混合液的凍存管放入-80℃冰箱,，長期冷凍保存,。7.若研究者需要液氮保存時(shí)，可將完全凍結(jié)的凍存管（放入-80℃冰箱后至少一晝夜）移至-196℃液氮罐,。無血清細(xì)胞凍存液不含牛血清,，無動(dòng)物源組份。

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是“慢凍快融”,，這樣可以較大限度的保存細(xì)胞活力,。目前細(xì)胞凍存多用二甲基亞砜（DMSO）作為保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性,；緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少冰晶對細(xì)胞的物理損傷,。復(fù)蘇細(xì)胞采用快速融化的方法可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷,。血清完全細(xì)胞凍存液,，通用于各種動(dòng)物細(xì)胞株,。特別配方有效提高細(xì)胞存活率和活力。不含動(dòng)物來源性蛋白,，能減少各類病毒,、霉菌和支原體等污染，確保凍存細(xì)胞安全,。適合用于無血清培養(yǎng)細(xì)胞和蛋白表達(dá)細(xì)胞,。將融化后的含細(xì)胞的冷凍保存液迅速析出置于新鮮培養(yǎng)基中充分混勻。上海長沙無血清細(xì)胞凍存液

無血清細(xì)胞凍存液的優(yōu)勢：因不含血清,，批次間差異小,。上海長沙無血清細(xì)胞凍存液

無血清細(xì)胞凍存液對比含血清細(xì)胞凍存液的優(yōu)勢：傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存液是使用培養(yǎng)基、血清和DMSO按照一定的比例混合,，其中DMSO的含量是10%,，血清的含量是10%，統(tǒng)稱為含血清細(xì)胞凍存液,。含血清細(xì)胞凍存液的一般的凍存方法是梯度降溫凍存法,，如先將冷凍管置于4℃冰箱10分鐘，然后移至-20℃冰箱30分鐘,，再移至-80℃冰箱保存16-18個(gè)小時(shí)（或隔夜）,，較后才移至液氮罐中進(jìn)行長期的儲(chǔ)存。（其中需要注意的是-20℃條件下不可超過1個(gè)小時(shí),，以防止冰晶過大,，造成細(xì)胞大量的死亡。）上海長沙無血清細(xì)胞凍存液