使用RFect系列小核酸轉(zhuǎn)染試劑做siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染測(cè)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞接種：一般做轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種/鋪板（細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml），使做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在30-50%,；如果細(xì)胞是原代細(xì)胞,，接種密度可以密一些，細(xì)胞計(jì)數(shù)在2*10^6cell/ml,；懸浮細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/鋪板（細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml）,，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度30-40%。2.為了能在使用時(shí)有較好的轉(zhuǎn)染效果,，靠前次使用建議您用24孔板做,，每孔2ul轉(zhuǎn)染試劑即可。將較佳轉(zhuǎn)染條件（siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量,、比例）放大到對(duì)應(yīng)的孔板即可~要避免經(jīng)常翻動(dòng)和振動(dòng),，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會(huì)脫落飄起。濟(jì)南原代細(xì)胞分離試劑盒產(chǎn)品介紹

原代細(xì)胞的獲?。好赶ǎ核迷噭耗z原酶和胰酶,。膠原酶的配制：建議看相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進(jìn)行配制,，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）,。胰酶（酶聯(lián)合法獲取原代細(xì)胞中會(huì)加入胰酶，相關(guān)文章也蠻多的）膠原酶消化時(shí)間：根據(jù)組織特性,，消化時(shí)間會(huì)有差異,。以小鼠腎細(xì)胞為例，加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后,，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右,，期間每10min中震蕩一次，知道組織塊幾乎完全消失為止（若是組織塊剪得非常細(xì)小,，時(shí)間可以短一些，30min左右即可）,。濟(jì)南正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒推薦廠家具有體內(nèi)組織特異性特征并且純度高,。

原代細(xì)胞的定義：原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和部位后立即進(jìn)行培養(yǎng),。因此,，較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng),，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞,，仍然保留二倍體數(shù),。但實(shí)際上，我們通常把靠前代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng),。原代細(xì)胞因?yàn)榭梢阅M機(jī)體的功能,，主要用于：生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究,。原代細(xì)胞對(duì)解凍過(guò)程非常敏感,，因此將小瓶置于37℃水浴鍋中，保持并輕輕旋轉(zhuǎn)直到內(nèi)容物剛剛解凍是很重要的,。然后應(yīng)立即從水浴中取出小瓶,，并轉(zhuǎn)移到無(wú)菌操作臺(tái)。確保您的培養(yǎng)瓶在解凍前已經(jīng)準(zhǔn)備就緒,，以便可以立即用于接種細(xì)胞,，并置于培養(yǎng)箱中，使用cellsystems的原代細(xì)胞時(shí),，復(fù)蘇的時(shí)候不建議離心,，第二天換個(gè)液就可以。

細(xì)胞凍存：通常我們不推薦重新凍存原代細(xì)胞,，因?yàn)檫@可以促進(jìn)細(xì)胞衰老和/或?qū)е鹿δ茏兓?。原代?xì)胞非常敏感，重新凍結(jié)可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡或損傷,。與細(xì)胞系不同,，原代細(xì)胞增殖有限，我們建議盡早使用原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以防止遺傳漂移,，如果你正在使用一個(gè)增殖困難的細(xì)胞類型,，你應(yīng)該密切監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)，因?yàn)樯倭炕祀s的細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）可能隨著時(shí)間的推移,，大量生長(zhǎng)從而成為主要細(xì)胞,。正常的原代細(xì)胞培養(yǎng)，在無(wú)污染的情況下,，建議培養(yǎng)基中不加抗體,，抗體會(huì)影響細(xì)胞的某些基因變異從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有差異，所以cellsystems的細(xì)胞在分離提取時(shí)就考慮到這點(diǎn),，他們不會(huì)采用任何抗體去分離和純化的同時(shí),，通過(guò)酶消化或者離心洗滌的方法讓細(xì)胞達(dá)到95%以上的純度，這樣得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確,。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過(guò)快,，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染,。

原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟（以24孔培養(yǎng)板為例）：A.細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種細(xì)胞，每孔500μl培養(yǎng)基（不可加物品）,，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)密度在30-50%,。B.siRNA-RFectPM混合物準(zhǔn)備：1.6pmolsiRNA用50μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。2.2μlRFectPM用50μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋,。輕輕混勻,，室溫孵育5min。注意：確保在25min內(nèi)執(zhí)行第三步操作,，不要過(guò)于延遲,。3.孵育5min后，將siRNA稀釋液與RFectPM稀釋液混合（總體積100μl）,。輕輕混勻,，室溫孵育20min。C.將混合物加到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）：1.將100μl混合物加入培養(yǎng)孔內(nèi),，培養(yǎng)孔內(nèi)含有0.5ml培養(yǎng)的細(xì)胞,。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，混勻,。2.37°C培養(yǎng)18-72h,，檢測(cè)基因克制效果。如果需要,，細(xì)胞培養(yǎng)4-6h時(shí)可以更換培養(yǎng)基,，但不是必須。孵育時(shí)間的長(zhǎng)短,，取決于細(xì)胞類型,、所干擾基因本身及分析方法?？稍O(shè)置不同的孵育時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定較佳孵育時(shí)間,。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)優(yōu)化:為了提高轉(zhuǎn)染效率，較好對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化,，特別是開(kāi)始使用,。以5ml為較低限度，否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害,。濟(jì)南原代細(xì)胞分離試劑盒產(chǎn)品介紹

貼壁細(xì)胞多來(lái)自部位組織,，而懸浮細(xì)胞多來(lái)自血液系統(tǒng)的細(xì)胞。濟(jì)南原代細(xì)胞分離試劑盒產(chǎn)品介紹

這種有限的分裂能力體內(nèi)的細(xì)胞相似,，一旦細(xì)胞在體內(nèi)完全分化以發(fā)揮其特殊功能,，細(xì)胞將停止增殖-這是固有的保護(hù)性衰老過(guò)程。此外，某些原代細(xì)胞有絲分裂后,，無(wú)論是在體內(nèi)或體外培養(yǎng)中都不增殖（例如，神經(jīng)元,，骨骼肌細(xì)胞,，心肌細(xì)胞，周細(xì)胞,，終末分化的肝細(xì)胞）,。因此，每次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后,，原代細(xì)胞培養(yǎng)都需要再次從新鮮的組織中解離,。原代細(xì)胞應(yīng)用困局：經(jīng)過(guò)一次傳代后，原代細(xì)胞培養(yǎng)物就會(huì)成為二級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物,，也稱為細(xì)胞株,。然而，盡管稱為細(xì)胞株,，但其壽命是有限的（除非如前所述永生化）濟(jì)南原代細(xì)胞分離試劑盒產(chǎn)品介紹