分散細(xì)胞培養(yǎng)大致步驟為:將動物組織從機體中取出離散成單個細(xì)胞(常用胰蛋白酶),,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),,使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖(注意整個過程無菌),。原代培養(yǎng):當(dāng)采用外科操作的方法將細(xì)胞從有機體中分離下來,,然后置于合適的培養(yǎng)環(huán)境中,它們會附著,、分裂和生長,。這稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)有兩種基本的方法,??壳胺N,使用外植塊,,將小片的組織粘附到玻璃或經(jīng)處理的塑料培養(yǎng)瓶中,,并浸于培養(yǎng)液中。幾天之后,,單個細(xì)胞將從組織外植塊中移動到培養(yǎng)瓶的表面或基質(zhì)中開始分裂生長,。第二種方法,也是使用更普遍的方法,,通過在組織碎片中加入消化(蛋白水解)酶,,如胰酶或膠原酶,消化成團聚集的細(xì)胞從而加快這一步驟,。得到單細(xì)胞的懸液,,然后將其置于含有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi),讓其繼續(xù)生長分裂,。這種方法成為酶解,。給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液,。珠海正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒
這種有限的分裂能力體內(nèi)的細(xì)胞相似,,一旦細(xì)胞在體內(nèi)完全分化以發(fā)揮其特殊功能,細(xì)胞將停止增殖-這是固有的保護性衰老過程,。此外,,某些原代細(xì)胞有絲分裂后,無論是在體內(nèi)或體外培養(yǎng)中都不增殖(例如,,神經(jīng)元,骨骼肌細(xì)胞,,心肌細(xì)胞,,周細(xì)胞,終末分化的肝細(xì)胞),。因此,,每次進行實驗后,,原代細(xì)胞培養(yǎng)都需要再次從新鮮的組織中解離。原代細(xì)胞應(yīng)用困局:經(jīng)過一次傳代后,,原代細(xì)胞培養(yǎng)物就會成為二級細(xì)胞培養(yǎng)物,,也稱為細(xì)胞株。然而,,盡管稱為細(xì)胞株,,但其壽命是有限的(除非如前所述永生化)開封原代細(xì)胞分離試劑盒廠家推薦只用于某些特定的細(xì)菌如豬傳染性腸胃炎細(xì)菌的培養(yǎng)。
原代細(xì)胞的幾大特點:1,、生命的起源原代細(xì)胞人體起源一個單細(xì)胞受精卵(*代干細(xì)胞),,經(jīng)歷卵裂(干細(xì)胞持續(xù)擴增,增加細(xì)胞數(shù)量),、胚層出現(xiàn)(干細(xì)胞開始分化出功能細(xì)胞),、組織部位形成(功能細(xì)胞的有序排列)及胚后發(fā)育這樣一個連續(xù)過程。2,、維持人體動態(tài)平衡的種子細(xì)胞人體通過干細(xì)胞化來實現(xiàn)細(xì)胞更新,。成年并不意味著細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的結(jié)束,而仍然存在著受調(diào)控的組織更新過程,。在一些組織中,,如骨髓、表皮等,,新細(xì)胞可不斷地產(chǎn)生,,以補充因分化而衰老、死亡的細(xì)胞,。干細(xì)胞的增殖保持著機體內(nèi)細(xì)胞的動態(tài)平衡,。
原代細(xì)胞與細(xì)胞系:原代細(xì)胞來源于或是新近死亡的供體,通過機械或酶方法解離獲得,,其方案根據(jù)來源物種(例如人,,小鼠)和所涉及的組織類型而變化。通常包含以下步驟:組織切割和切碎,,酶解,,反復(fù)洗滌,研磨和微濾分餾,,較后重新懸浮和接種收集的細(xì)胞群,。對于松散的、被纖維結(jié)締包圍的組織,,機械均質(zhì)化可能足以進行解離,。如果您的組織來源是外周血,差速離心便可以分離目的細(xì)胞,。由于與細(xì)胞分裂相關(guān)的染色體端??s短,,原代細(xì)胞在體外的壽命有限。大約20到60次分裂后,,端粒變得太短而無法承受另一個循環(huán),,導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。這種現(xiàn)象被稱為Hayflick極限,。對于具有無限倍增能力的細(xì)胞系,,必須通過細(xì)菌或化學(xué)誘導(dǎo)方法的轉(zhuǎn)化使其永生化。細(xì)菌對于細(xì)胞的基因編輯引入有效促進增殖的基因(例如SV-40,,E6,,E7),允許細(xì)胞無限的細(xì)胞分裂1,。同樣地,,化學(xué)誘導(dǎo)方法(例如電離輻射,氯化鎳,,苯并芘)改變原代細(xì)胞的基因組成,,也可實現(xiàn)無限增殖。當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞,。
膠原酶的配制:建議看相關(guān)的文獻進行膠原酶的配制,。小編常用的是DMEM進行配制,配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱(注意現(xiàn)用現(xiàn)配),。胰酶(酶聯(lián)合法獲取原代細(xì)胞中會加入胰酶,,相關(guān)文章也蠻多的)膠原酶消化時間:根據(jù)組織特性,消化時間會有差異,。以小鼠腎細(xì)胞為例,,加入膠原酶Ⅰ進行消化后,放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右,,期間每10min中震蕩一次,,知道組織塊幾乎完全消失為止(若是組織塊剪得非常細(xì)小,時間可以短一些,,30min左右即可),。原代細(xì)胞的獲取:酶消化法:所用試劑:膠原酶和胰酶可以在接種后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h,。珠海正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒
原代細(xì)胞是出了名的難養(yǎng),,對培養(yǎng)環(huán)境和實驗操作的要求更苛刻。珠海正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒
原代細(xì)胞培養(yǎng)問題:凍存的細(xì)胞該如何開始培養(yǎng):(1)將一管細(xì)胞從液氮罐中取出,,注意保護手和眼睛,。(2)將凍存管快速的放入37℃水浴中,輕輕握住并旋轉(zhuǎn),,直到管內(nèi)物體完全融化,。(3)將凍存管立即從水浴中拿出,擦干,,轉(zhuǎn)入無菌環(huán)境,。(4)用70%的酒精沖洗凍存管,然后擦去多余酒精,。(5)打開蓋子,,注意手指不要碰到里面的螺紋(注意,由于凍存管有負(fù)壓,,開蓋時可能會有少量溢出,,這是正常現(xiàn)象),。(6)用多聚賴氨酸(或參照說明書)包被培養(yǎng)瓶,。多數(shù)細(xì)胞推薦的接種密度為每平方厘米5000個細(xì)胞。珠海正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒