細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些：1.脂質(zhì)體法。中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi),。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體則不同，DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面,，經(jīng)過(guò)內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞,。脂質(zhì)體法始于1987年，此法的出現(xiàn)使得轉(zhuǎn)染效率,、轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較大提高,。陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對(duì)較高,，對(duì)不同的細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝。2.非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 ,。較新的納米聚合物轉(zhuǎn)染試劑,，如Entranster試劑，納米材料,，細(xì)胞毒性小,，轉(zhuǎn)染效率高，漸漸成為各大實(shí)驗(yàn)室的選擇轉(zhuǎn)染試劑,。蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的,。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷(xiāo)價(jià)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染，你至少要掌握以下幾點(diǎn)：主要有下面幾種方法：：化學(xué)法：磷酸鈣法,、DEAE-右旋糖苷法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法,；物理法：電穿孔法,、顯微注射法、顆粒傳遞法,；細(xì)菌介導(dǎo)法：逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌,、腺細(xì)菌A. 陽(yáng)離子脂質(zhì)體法：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單通用,，適用性廣,，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好,，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清,，轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類(lèi)型變化大,。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞,，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法,。B. 電穿孔法：利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾,，使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷(xiāo)價(jià)在轉(zhuǎn)染過(guò)程中是可以使用血清的,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：(1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A.將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物,。B.震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,，使用前還需震蕩，,。(2)選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基,。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,，再次震蕩,。(3)將混合液在室溫放置10—15分鐘。(4)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次,。(5)加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí),。(6)到時(shí)后,，根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí),。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法：人工脂質(zhì)體法 原理：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物,，進(jìn)而可被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染。這種方法幾乎適用于所有細(xì)胞,，轉(zhuǎn)染效率高,、重復(fù)型好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需要去除血清,，轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類(lèi)型變化大,。實(shí)驗(yàn)步驟：在單獨(dú)試管中分別稀釋核酸及轉(zhuǎn)染試劑 → 脂質(zhì)體與核酸的磷酸骨架結(jié)合，形成復(fù)合物 → 脂質(zhì)體上的正電荷有助于復(fù)合物與細(xì)胞膜結(jié)合 → 復(fù)合物通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿 → 分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或沉默情況,。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中往往都含有一個(gè)報(bào)告基,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類(lèi)型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用,，細(xì)胞太少,，容易死。一般轉(zhuǎn)染時(shí),，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)滿或處于靜止期,。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感,，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量,。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做啟動(dòng)子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白,。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動(dòng)子,，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細(xì)菌)相比,，在BHK-21中其活性較高。這三種細(xì)菌啟動(dòng)子在T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系,，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低,。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動(dòng)Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子,，而單PMA就足以啟動(dòng)KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時(shí)會(huì)提高,，因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成,。細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類(lèi)型或應(yīng)用而異。南昌正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家

對(duì)于原代細(xì)胞,，可用促有絲分裂刺激物進(jìn)行細(xì)胞活化,。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷(xiāo)價(jià)

影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的因素：1.轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系不匹配轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系也是講究配合默契的，使用同一種試劑,，不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同,。但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑,。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn),，通過(guò)這些資料可選擇較適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然,，較適合的是高效,、低毒、方便,、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑。因?yàn)橛行┘?xì)胞系是不穩(wěn)定的,，可能隨著培養(yǎng)時(shí)間的改變,，培養(yǎng)條件的不同，不同的選擇壓力,，可能引起不同的克隆選擇,。因此就算是同一個(gè)細(xì)胞系，在不同條件下轉(zhuǎn)染能力的差異可能會(huì)很大,。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷(xiāo)價(jià)

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