如何高效率實現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染：DNA轉(zhuǎn)染導入細胞胞漿內(nèi)的DNA 不能穿過細胞核的核膜（"核屏障"）。在細胞有絲分裂過程中核膜溶解,，DNA進入細胞核才有可能,。為此，細胞處于分裂期對DNA轉(zhuǎn)染是至關(guān)重要的,，并且處于分裂期的細胞比例必須盡可能大才能實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染,。DNA轉(zhuǎn)染機制示意圖如下所示：轉(zhuǎn)染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對于RNA轉(zhuǎn)染是沒有"核屏障"的,，因為RNA不需要進入細胞核發(fā)揮其生物學效應(yīng)，因此細胞分裂對它沒有影響,。轉(zhuǎn)染試劑的選擇理想的轉(zhuǎn)染試劑選擇可以使您的實驗如虎添翼,！真核細胞的先天免疫系統(tǒng)，使它們能夠檢測外來物質(zhì)如脂多糖,、細菌或細菌核酸和蛋白質(zhì),，并克制潛在病原體的入侵。此外,，細胞通過信使分子向臨近細胞傳遞發(fā)現(xiàn)有害物質(zhì)的信號,。因此，這些臨近細胞甚至無需接觸病原體即可采取防御方式,。這種細胞先天免疫系統(tǒng)也是轉(zhuǎn)染成功的一個障礙,。瞬時表達分析檢測未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達。金華開封細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細胞轉(zhuǎn)染的注意事項：細胞狀態(tài)這點非常重要,，不要急于求成,，一定要讓細胞處于較佳的生長狀態(tài)再做。有文獻說傳代不要超過17代,。細胞復蘇后的3代左右時細胞狀態(tài)較好,，不要用傳了很多代的細胞去做，細胞的形態(tài)都會發(fā)生變化,。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體,，原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,。這會導致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,，融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉(zhuǎn)染活性,。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復較佳結(jié)果,。或者,，幾種來源于經(jīng)篩選,，轉(zhuǎn)染效率較高細胞亞系的細胞系現(xiàn)在有售。正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家建議選擇50%~80%區(qū)間密度進行細胞轉(zhuǎn)染,。

細胞轉(zhuǎn)染方法：1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi),，形成DNA脂復合物,，也能被表面帶負電的細胞膜吸附,，再通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,，是目前實驗室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一,，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法,。由于脂質(zhì)體對細胞有一定的毒性,，所以轉(zhuǎn)染時間一般不超過24小時。常用細胞類型：cos-7 ,、BHK,、NIH3T3 、Hela等2.電穿孔轉(zhuǎn)染法電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進入胞內(nèi),，這種方法就是電穿孔,。當遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下,，高電場強度會殺死50%-70% 的細胞?，F(xiàn)在針對細胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護劑，可以較大的降低細胞的死亡率,，同時提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率,。

細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.試劑過期有時候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況,。毛博當年做轉(zhuǎn)染整整半年,，百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),，原來是Lipofectamine 2000過期了,。換了之后，立馬成功,。根據(jù)我的經(jīng)驗,，盡量使用開封半年內(nèi)的，因為過了半年后,，就算沒有過失效期，但是細胞毒性較大增加,，而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降,。千萬不要為了省錢，影響實驗進度哈,。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時加入血清,，會導致細胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基,。根據(jù)毛博的經(jīng)驗,，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清,。這個時候，較好不要換液,，不要打擾細胞,，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清,。過早的話,，會引起未轉(zhuǎn)染的細胞瘋狂生長。那么,，什么是較佳時機呢,？在20%的細胞變圓的時候，就是加血清的較佳時機,。瞬時和穩(wěn)定表達DNA轉(zhuǎn)染后,，轉(zhuǎn)入基因的表達可以在1－4天內(nèi)檢測到。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的篩選：生長的細胞比不分裂的細胞更快的受到GENETICIN物品的影響,。轉(zhuǎn)染后,，在開始篩選前等待48-72小時，使細胞表達足夠量的抗性酶,，保證在開始篩選時可以自我保護,。轉(zhuǎn)染后48-72小時倒掉培養(yǎng)基，加入含有GENETICIN物品的培養(yǎng)基,，物品的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定,，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細胞。因為許多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度,，包括細胞類型,，培養(yǎng)基和血清濃度等，所以有必要對每種細胞作一個劑量反應(yīng)曲線,，確定較佳濃度,。篩選較多可能需要一周時間，因為在致死劑量的GENETICIN物品存在條件下,，細胞會分裂1-2次,。在次培養(yǎng)細胞時使用較低劑量的物品，一般是篩選劑量的一半,。篩選后的細胞一般是離散的克隆,，根據(jù)實驗?zāi)康牟煌梢苑謩e純化（克?。?，收集進行大量培養(yǎng)或染色并進行抗性克隆的計數(shù)。一般的瞬時轉(zhuǎn)染 方法多采用脂質(zhì)體法,。徐州正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價格

脂質(zhì)體可以和帶負電荷的核酸結(jié)合后重新形成復合物,。金華開封細胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細胞轉(zhuǎn)染實驗簡介：實驗材料與器材：1,、材料293T細胞、MyoD表達質(zhì)粒和EGFP表達質(zhì)粒,、DMEM培養(yǎng)基,、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清),、PBS(磷酸鹽緩沖溶液),、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)2,、器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈,、廢液缸、血球計數(shù)板,、渦旋振蕩器,、恒溫水浴箱、臺式離心機,、35mm培養(yǎng)皿,、轉(zhuǎn)染管、15ml離心管,、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD,。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 法較重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,，細胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題,，通過實驗摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。金華開封細胞高效轉(zhuǎn)染試劑