細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介：實(shí)驗(yàn)材料與器材：1,、材料293T細(xì)胞,、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基,、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清),、PBS(磷酸鹽緩沖溶液),、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)2,、器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈,、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板,、渦旋振蕩器,、恒溫水浴箱、臺(tái)式離心機(jī),、35mm培養(yǎng)皿,、轉(zhuǎn)染管、15ml離心管,、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD,。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 法較重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題,，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。直到外源基因在細(xì)胞分裂過(guò)程中因各種因素丟失為止,。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價(jià)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染之PEI 轉(zhuǎn)染法：1.細(xì)胞分盤(pán)：通過(guò)胰酶消化收集細(xì)胞,，用適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基以 1×105 至 4×105細(xì)胞/cm2 的密度平鋪細(xì)胞于 35 mm 培養(yǎng)皿上（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇培養(yǎng)皿，使細(xì)胞貼壁后所占面積達(dá)到培養(yǎng)皿總面積的 70－90％）,。將細(xì)胞置于含 5％CO2 的 37℃溫箱中孵育 8-24 h,，當(dāng)細(xì)胞貼壁完全后即可開(kāi)始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前 2 h 換液（用 1.5 ml 無(wú)血清培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基）,。注：PEI轉(zhuǎn)染法對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有克制作用,，在換液前細(xì)胞幾乎不生長(zhǎng)，所以需要密度比較大時(shí)做轉(zhuǎn)染。2.制備PEI-DNA 混合物以 35 mm 組織培養(yǎng)皿用 240 μl 反應(yīng)總體積為例,。先在無(wú)菌EP管中加入120 μl 1×HBS,再加入質(zhì)粒 DNA（總量 1-3 μg 為佳）,，混勻后加入等體積 PEI工作液，充分混勻后室溫靜置 20-30 min ,，較后將這 240 μl 的PEI-DNA混合液逐滴加入上述單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中,，輕輕搖動(dòng)平皿混勻后置于含 5％ CO2的 37℃溫箱孵育。徐州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑單價(jià)脂質(zhì)體可以和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后重新形成復(fù)合物,。

如何有效提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)效率：1.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同,，但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑,。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn),，通過(guò)這些資料可選擇較適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然,，較適合的是高效,、低毒、方便,、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑,。2.保持較佳的細(xì)胞狀態(tài)一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確保基因型不變,。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過(guò)幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，較容易轉(zhuǎn)染,。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化,。也就是說(shuō)同一種系的細(xì)胞株,，在各實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變,，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化,。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低,，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些：1.脂質(zhì)體法。中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi),。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體則不同，DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過(guò)內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞,。脂質(zhì)體法始于1987年,，此法的出現(xiàn)使得轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較大提高,。陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對(duì)較高,，對(duì)不同的細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝。2.非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 ,。較新的納米聚合物轉(zhuǎn)染試劑,，如Entranster試劑，納米材料,，細(xì)胞毒性小,，轉(zhuǎn)染效率高，漸漸成為各大實(shí)驗(yàn)室的選擇轉(zhuǎn)染試劑,。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,，外源基因得以表達(dá)但它們并不會(huì)整合到細(xì)胞的基因組中。

如何高效率實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)化,、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)幾個(gè)名詞是從事生命科學(xué)研究的初學(xué)者經(jīng)常碰到的,，也是讓人容易混淆的,。他們之間有什么區(qū)別和聯(lián)系呢：轉(zhuǎn)化(transformation)指將質(zhì)粒或其它外源DNA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞（原核生物）,，并使宿主細(xì)胞獲得新的表型的過(guò)程,。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)由噬菌體或細(xì)胞細(xì)菌介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過(guò)程稱轉(zhuǎn)導(dǎo)或傳染（Infection）。轉(zhuǎn)染(transfection)是指真核細(xì)胞主動(dòng)或者被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新表型的過(guò)程,。對(duì)于真核生物,，轉(zhuǎn)染就是原核生物中轉(zhuǎn)化的同義詞。轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染是將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程,，是細(xì)胞和分子生物學(xué)研究的重要工具,。在現(xiàn)生命可續(xù)研究中，大部分的工作是利用基因功能研究來(lái)探索生命過(guò)程,，如何將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)是科學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不可缺少的實(shí)驗(yàn)技術(shù),，而細(xì)胞轉(zhuǎn)染是完成這一過(guò)程的必需步驟。震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存,，使用前還需震蕩,。天津細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家

其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點(diǎn),。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價(jià)

轉(zhuǎn)染技術(shù)：國(guó)際上推出了一些陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù),，以其適用宿主范圍廣，操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞毒性小,，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞,。其中樹(shù)枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)的轉(zhuǎn)染性能較佳,，但樹(shù)枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性,，且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽(yáng)離子電荷密度的有機(jī)大分子,，每相隔二個(gè)碳個(gè)原子,，即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(protonsponge)體,。這種聚陽(yáng)離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞,，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進(jìn)一步的改性后,，其轉(zhuǎn)染性能好于樹(shù)枝狀聚合物,，而且它的細(xì)胞毒性低。大量實(shí)驗(yàn)證明,，PEI是非常有希望的基因治好載體,。目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí)，PEI經(jīng)常做為中心組成成分,。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價(jià)