原理：在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,，通過熒光化學(xué)物質(zhì)測定每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量,。目的：實(shí)現(xiàn)定量而不止是定性分析,。通過與內(nèi)參基因進(jìn)行對(duì)比，對(duì)樣品中的特定基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算,，以實(shí)現(xiàn)定量分析,。qPCR的檢測方法有兩種，SYBRGreenl法和TaqMan探針法,，下面介紹常用的SYBRGreenl法,。原理：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料,，使其特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào),，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。試劑及儀器：Hieff®QpcrSYBR®GreenMasterMix試劑(翌圣)和ABI7500Real-TimeSystem實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,。自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)被發(fā)明以來,，其簡單、可靠,、快速,、靈敏的質(zhì)量，PCR是分子生物學(xué)中使用的技術(shù),。深圳單通道qPCR儀供應(yīng)商

PCR：Polymerase chain reaction. 是體外模擬生物的DNA 復(fù)制,。需要DNA 聚合酶，DNA 模板,，兩端引物,，脫氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及適當(dāng)?shù)木彌_體系。PCR 產(chǎn)物的增長形式為２N (如果各種試劑和外部所加條件均理想化,，N 是循環(huán)數(shù)),。實(shí)際中，擴(kuò)增效率不為100％,。Real time PCR 是定量PCR 的一種,，當(dāng)然是在PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展出來的。（普通）PCR 包含很多因素,，屬性,，如：試劑，溫度,，循環(huán)數(shù),，程序，PCR 產(chǎn)物（擴(kuò)增子,，amplicon）的量,，擴(kuò)增曲線（擴(kuò)增子累積曲線）,，摻錯(cuò)率，擴(kuò)增子長度,。一般來說,，人們關(guān)心的是擴(kuò)增子的量。而real time PCR 主要利用的是擴(kuò)增曲線（amplification curve）, 循環(huán)數(shù),；擴(kuò)增子長度,，擴(kuò)增效率，擴(kuò)增子多少,，也加以考慮,。深圳單通道qPCR儀供應(yīng)商熒光檢測系統(tǒng)可接收熒光信號(hào)，每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)熒光分子形成,，熒光信號(hào)累積和PCR產(chǎn)物形成是同步。

制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化現(xiàn)在含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離,，需要解交聯(lián)并純化DNA,。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時(shí)可以停止ChIP,。經(jīng)過解交聯(lián)和/或DNA純化后,，可以將樣品于-20°C儲(chǔ)存。定量DNA——測定目標(biāo)蛋白質(zhì)-DNA水平在該步驟中,，通過qPCR定量純化的DNA產(chǎn)物,，通過qPCR，您可以確定目標(biāo)蛋白是否存在于特定位點(diǎn),。ChIP的qPCR如何定量分析ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)需要針對(duì)可變性來源進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,，包括染色質(zhì)數(shù)量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率,。兩種常用的標(biāo)準(zhǔn)化 ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)方法——Percent Input法和富集倍數(shù)法（Fold Enrichmen）,。與input相關(guān)的ChIP-qPCR數(shù)據(jù)包括ChIP的背景水平和input染色質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化。建議ChIP 實(shí)驗(yàn)重復(fù),，盡可能將結(jié)果與背景信號(hào)和標(biāo)準(zhǔn)誤差一起顯示,。

所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時(shí)候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）,。我們以 ABI StepOne為例,，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：A. 首先是實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”,，進(jìn)行“定量”實(shí)驗(yàn),。B. 實(shí)驗(yàn)方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序,，以cDNA為模板進(jìn)行,。C. 目的基因的設(shè)置：有幾個(gè)目的基因和目的基因的名稱,。D. 樣品的設(shè)置：包括哪個(gè)是實(shí)驗(yàn)組，哪個(gè)是對(duì)照組,。以及負(fù)對(duì)照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置,。E. 對(duì)照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個(gè)是為后面的定量做準(zhǔn)備F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）,。循環(huán)反應(yīng)是95℃15秒,，60℃15秒的40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以,?；蛘呤莾x器說明書上建議的程序。G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：A-G這五個(gè)步驟簡單設(shè)置好,，可以保存,，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。

qPCR面對(duì)小的差異較弱,，dPCR則可識(shí)別差異較小的拷貝數(shù)。

染料法是指在qPCR反應(yīng)體系中加入一種與雙鏈DNA分子結(jié)合的熒光染料,，包括SYBR®Green I,、BEBO和LC Green TMI等染料，它們可以與雙鏈DNA（double strands DNA,，dsDNA）的小溝非特異性結(jié)合,，激發(fā)較強(qiáng)的熒光產(chǎn)生。經(jīng)熒光定量PCR儀器檢測后,，對(duì)核酸進(jìn)行定性和定量分析,。qPCR 染料法原理:這種方法的優(yōu)點(diǎn)是，需要一對(duì)特異性引物,，操作簡單,、檢測成本低。缺點(diǎn)是由于熒光染料非特異結(jié)合dsDNA產(chǎn)物,，無法正確區(qū)分目的產(chǎn)物,，尤其是染料結(jié)合引物二聚體易產(chǎn)生錯(cuò)誤的擴(kuò)增曲線，易形成誤判,。雖然在PCR擴(kuò)增程序后添加熔解曲線分析,，可以方便判斷生成的熒光擴(kuò)增曲線是否屬于目的產(chǎn)物，但是對(duì)于高靈敏度要求的實(shí)驗(yàn)來說,，染料法并不是比較好的選擇,。與標(biāo)準(zhǔn) PCR 一樣，SYBR Green 方案由變性,、退火和延伸階段組成,。深圳單通道qPCR儀供應(yīng)商

PCR 反應(yīng)中通過控制溫度變化使得核酸分子重復(fù)地解鏈與延伸,，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的指數(shù)擴(kuò)增。深圳單通道qPCR儀供應(yīng)商

Quantagene q225 系列熒光定量PCR 43分鐘完成實(shí)驗(yàn),，再加3分鐘做完熔解曲線需43分鐘即可完成一個(gè)40循環(huán)的常規(guī)qpcr實(shí)驗(yàn),。DNA熔解曲線的檢測快可在3分鐘內(nèi)完成。使用快速試劑,，30個(gè)熱循環(huán)的檢測更可縮短至20分鐘,。精密設(shè)計(jì)的加熱塊和孔板q225的加熱塊經(jīng)過精密設(shè)計(jì)，能夠很大程度地貼合孔板形狀,，實(shí)現(xiàn)高效的熱傳導(dǎo),，使得在加熱塊達(dá)到預(yù)定溫度后反應(yīng)溶液也能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到相同溫度，反應(yīng)溶液溫度更為均一,?？焖傺h(huán)，穩(wěn)定溫度 q225 出色的熱循環(huán)系統(tǒng)設(shè)計(jì)使得40 個(gè)循環(huán)的常規(guī) qPCR 可以在短短43 分鐘內(nèi)輕松完成,，讓您的工作效率獲得質(zhì)的提升,。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中溫度穩(wěn)定，不受實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長而導(dǎo)致的機(jī)器內(nèi)部背景溫度上升的影響,。深圳單通道qPCR儀供應(yīng)商

廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司是一家儀器儀表批發(fā);商品批發(fā)貿(mào)易（許可審批類商品除外）;商品零售貿(mào)易（許可審批類商品除外）;教學(xué)設(shè)備的研究開發(fā);辦公設(shè)備耗材批發(fā);生物技術(shù)開發(fā)服務(wù);生物技術(shù)推廣服務(wù);計(jì)算機(jī)批發(fā);生物技術(shù)轉(zhuǎn)讓服務(wù);農(nóng)業(yè)科學(xué)研究和試驗(yàn)發(fā)展;醫(yī)學(xué)研究和試驗(yàn)發(fā)展;自然科學(xué)研究和試驗(yàn)發(fā)展;水處理設(shè)備的研究,、開發(fā);食品科學(xué)技術(shù)研究服務(wù);環(huán)保設(shè)備批發(fā);辦公設(shè)備批發(fā);的公司，是一家集研發(fā),、設(shè)計(jì),、生產(chǎn)和銷售為一體的專業(yè)化公司。公司自創(chuàng)立以來,，投身于數(shù)字PCR,，純水機(jī)，病理切片機(jī),，倍性分析儀,，是精細(xì)化學(xué)品的主力軍。雙螺旋科學(xué)儀器致力于把技術(shù)上的創(chuàng)新展現(xiàn)成對(duì)用戶產(chǎn)品上的貼心,，為用戶帶來良好體驗(yàn),。雙螺旋科學(xué)儀器創(chuàng)始人姜艷，始終關(guān)注客戶,，創(chuàng)新科技,，竭誠為客戶提供良好的服務(wù)。