實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR,，qPCR）通過(guò)在普通 PCR 反應(yīng)體系中加入了熒光標(biāo)記探針或熒光染料，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物變化,。通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。具有專(zhuān)一性更高,、可實(shí)時(shí)監(jiān)控,、可重復(fù)精確定量等優(yōu)勢(shì)。qPCR的種類(lèi)根據(jù)qPCR的化學(xué)發(fā)光原理一般分為2大類(lèi)：一類(lèi)是探針?lè)?，利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加,；一類(lèi)是基于SYBR Green I 的染料法，通過(guò)熒光染料來(lái)指示產(chǎn)物的增加,。SYBR Green I 是一種結(jié)合于所有雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料,。蘇州準(zhǔn)確qPCR儀設(shè)置

qPCR中的熒光探針是一種短鏈寡核苷酸，帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán),，它可以特異結(jié)合目的產(chǎn)物的DNA序列,。其檢測(cè)原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），即熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)在目標(biāo)DNA分子擴(kuò)增過(guò)程中因?yàn)榫酆厦傅耐馇谢钚詮亩夥蛛x使熒光信號(hào)的釋放,；隨著擴(kuò)增過(guò)程的推進(jìn),，機(jī)器實(shí)時(shí)檢測(cè)增強(qiáng)的熒光信號(hào),，從而產(chǎn)生終的熒光擴(kuò)增曲線,。根據(jù)修飾基團(tuán)標(biāo)記和能量轉(zhuǎn)移方式，可以將探針?lè)譃門(mén)aqMan探針,、分子信標(biāo)和其他探針,。TaqMan探針（熒光淬滅水解探針）現(xiàn)今常用的TaqMan探針主要是水解探針，其多是5’端標(biāo)記熒光基團(tuán),，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)的短單鏈寡聚核苷酸,。在qPCR反應(yīng)中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性,，對(duì)TaqMan探針進(jìn)行切割,，使熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)不會(huì)被淬滅,，釋放的熒光信號(hào)被機(jī)器接收,。TaqMan探針的qPCR相比于染料法多了一條TaqMan探針，可以特異性結(jié)合DNA序列，因而具有更好的特異性,，但探針合成價(jià)格偏高,。華南地區(qū)靈敏度qPCR儀設(shè)置qPCR通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期）,，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好,，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,。外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的,、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性比較好的定量方法,，已得到全世界的公認(rèn)，范圍廣用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究,，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域,。

內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用：由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè),，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí),，檢測(cè)重現(xiàn)性極差,。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異,，因此無(wú)法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量,。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性,。但即使如此,，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量,、粗略定量的方法。3．內(nèi)標(biāo)對(duì)定量PCR的影響：若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo),，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR,，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí),，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為***,。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無(wú)法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo),。也正是這個(gè)原因,，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法,。由于qPCR的高靈敏性,，陰性對(duì)照有出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)的情況，那么在針對(duì)這類(lèi)問(wèn)題時(shí),，我們需要判斷其原因所在,。

TwoSteprt-pcr和OneSteprt-pcr的選擇RealTimeRT-PCR反應(yīng)可選擇TwoSteprt-pcr反應(yīng)或OneStepRT-PCR反應(yīng),TwoStepRT-PCR反應(yīng)是將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和RealTimePCR反應(yīng)分兩步進(jìn)行。進(jìn)行TwoStepRT-PCR反應(yīng)時(shí),可選擇RandomPrimer,、OligodtPrimer或基因的特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),然后再將一部分反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(cDNA)作為模板添加到RealTimePCR反應(yīng)液中,。使用反轉(zhuǎn)錄引物時(shí)可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的反轉(zhuǎn)錄引物,如果選擇RandomPrimer或OligodtPrimer,合成的cDNA可用于復(fù)數(shù)種類(lèi)基因的檢測(cè),cDNA溶液可以穩(wěn)定地長(zhǎng)期保存,供以后解析使用。OneSteprt-pcr的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行,操作簡(jiǎn)單,污染幾率低,。但此時(shí)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)都并非為各自的適條件,所以O(shè)neSteprt-pcr通常比TwoStepRT-PCR反應(yīng)效率低,。此外,與TwoStepPCR反應(yīng)相比,反轉(zhuǎn)錄酶等的使用量多,每個(gè)反應(yīng)的成本相對(duì)較高。OneSteprt-pcr反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物只能使基因的特異性PCR下游引|物,而不能使用Randomprimer或OligodtPrimer共用引物,?；虮磉_(dá)解析等絕大部分RT-PCR,適合選擇TwoSteprt-pcr反應(yīng),而RNA病毒檢測(cè)等以基因檢測(cè)為目的RT-CR反應(yīng),應(yīng)優(yōu)先考慮防止污染,所以比較好選擇OneSteprt-pcr反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）指的是在PCR進(jìn)行的同時(shí),，對(duì)其過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)的能力,。華南地區(qū)靈敏度qPCR儀設(shè)置

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,。蘇州準(zhǔn)確qPCR儀設(shè)置

qpcr的檢測(cè)原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan),，利用實(shí)時(shí)積累的熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析,。qPCR 主要是依賴于標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而去確定未知樣品的濃度,，因此是一種相對(duì)定量的方法,。隨著PCR的循環(huán)進(jìn)行，染料熒光強(qiáng)度增加,，從而檢測(cè)到定量反應(yīng)的DNA,。SYBR Green是一種DNA插入染料,，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針?lè)椒ū阋?，但是特異性沒(méi)有熒光探針?lè)椒ê?。蘇州準(zhǔn)確qPCR儀設(shè)置

廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司是以數(shù)字PCR，純水機(jī),，病理切片機(jī),，倍性分析儀研發(fā)、生產(chǎn),、銷(xiāo)售,、服務(wù)為一體的儀器儀表批發(fā);商品批發(fā)貿(mào)易（許可審批類(lèi)商品除外）;商品零售貿(mào)易（許可審批類(lèi)商品除外）;教學(xué)設(shè)備的研究開(kāi)發(fā);辦公設(shè)備耗材批發(fā);生物技術(shù)開(kāi)發(fā)服務(wù);生物技術(shù)推廣服務(wù);計(jì)算機(jī)批發(fā);生物技術(shù)轉(zhuǎn)讓服務(wù);農(nóng)業(yè)科學(xué)研究和試驗(yàn)發(fā)展;醫(yī)學(xué)研究和試驗(yàn)發(fā)展;自然科學(xué)研究和試驗(yàn)發(fā)展;水處理設(shè)備的研究、開(kāi)發(fā);食品科學(xué)技術(shù)研究服務(wù);環(huán)保設(shè)備批發(fā);辦公設(shè)備批發(fā);企業(yè),，公司成立于2015-04-17,，地址在廣州市黃埔區(qū)銳豐三街4號(hào)617房。至創(chuàng)始至今,，公司已經(jīng)頗有規(guī)模,。公司主要產(chǎn)品有數(shù)字PCR，純水機(jī),，病理切片機(jī),，倍性分析儀等，公司工程技術(shù)人員,、行政管理人員,、產(chǎn)品制造及售后服務(wù)人員均有多年行業(yè)經(jīng)驗(yàn)。并與上下游企業(yè)保持密切的合作關(guān)系,。臻準(zhǔn),美國(guó)艾科浦,銳訊生物,Sysmex,Eprerdia致力于開(kāi)拓國(guó)內(nèi)市場(chǎng),，與精細(xì)化學(xué)品行業(yè)內(nèi)企業(yè)建立長(zhǎng)期穩(wěn)定的伙伴關(guān)系，公司以產(chǎn)品質(zhì)量及良好的售后服務(wù),，獲得客戶及業(yè)內(nèi)的一致好評(píng),。廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司通過(guò)多年的深耕細(xì)作，企業(yè)已通過(guò)精細(xì)化學(xué)品質(zhì)量體系認(rèn)證,，確保公司各類(lèi)產(chǎn)品以高技術(shù),、高性能、高精密度服務(wù)于廣大客戶,。歡迎各界朋友蒞臨參觀,、 指導(dǎo)和業(yè)務(wù)洽談。