首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù),。激光掃描共聚焦顯微技術(shù),，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像,。在激光掃描共聚焦顯微鏡中,，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發(fā)光照射,，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測器前的（pinhole）,，有焦平面上的熒光信號能被探測器接收,。也就是說，每個時刻,，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式,，一個個點的信號就可以組合出終的圖像,。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是,，其采用的激發(fā)光波長較長,，只有當(dāng)兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點,，出才會激發(fā)出熒光,。也就是說，雙光子顯微鏡中,，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測,，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。對于顯微成像技術(shù)包含：寬場熒光顯微鏡,、激光共聚焦顯微鏡,、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡,、雙光子顯微鏡。進(jìn)口bruker雙光子顯微鏡光子探測

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率,，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對比,，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521 nm，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU,，對直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像,。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,，模擬計算顯示v2PE點擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率,。ultima雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實驗,，還有一些短波長可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實驗。

在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過1毫米,。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過1毫米,。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢,？

單光子顯微技術(shù)是成熟的熒光顯微技術(shù),，但由于其使用的激發(fā)光波長較短，成像深度有限,；能量較大,會造成對熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重,。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現(xiàn)樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細(xì)胞成像。而寬場顯微鏡能夠很好地實現(xiàn)實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實時檢測,，但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現(xiàn)多維成像,。雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學(xué)成像方法,采用長波激發(fā),，能對組織進(jìn)行深層次成像,。常用的比較好激發(fā)波長大多位于800-900nm，而水,、血液和固有組織發(fā)色團(tuán)對這個波段的光吸收率低,，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第,，光損傷小，適用于在體檢測,。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)置入的微電極位置,，從而觀察胞體、樹突甚至單個樹突棘的活性,。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細(xì)胞單個樹突棘中的鈣分布,。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的；進(jìn)口雙光子顯微鏡ultimainvestigator

雙光子顯微鏡不需要共聚焦,，提高了熒光檢測效率,。進(jìn)口bruker雙光子顯微鏡光子探測

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢,？答案是否定的,，任何事物都有優(yōu)缺點，何況一臺儀器呢,，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品,，對于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點進(jìn)行掃描,，對樣品的光毒性還是比較大的,，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時就更容易對樣品進(jìn)行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面,，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確,；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進(jìn)行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗,，效率非常低,。進(jìn)口bruker雙光子顯微鏡光子探測