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美國(guó)單通道膜片鉗研究

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-03-06

ePatch雖然設(shè)備非常小巧,,但功能完備,傳統(tǒng)膜片鉗設(shè)備能做的實(shí)驗(yàn),,用ePatch幾乎都能做,。具有voltage-clamp,,current-clamp,zero current-clamp三種模式,,自動(dòng)電極電壓飄移補(bǔ)償,,C-fast-C-slow-R-series-P/N補(bǔ)償,Bridge balance補(bǔ)償?shù)裙δ???梢宰鋈?xì)胞記錄也可以做單通道記錄,膜片鉗技術(shù)常做的離子通道電流,,突觸后電流,,動(dòng)作電位檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)都能輕松實(shí)現(xiàn)。公司還為此開發(fā)了友好的控制和記錄軟件,,筆者上手接觸了一下,,發(fā)現(xiàn)跟AXON的軟件類似,并且程序編輯更為簡(jiǎn)單易用,。所記錄到的數(shù)據(jù)可以直接使用Clampfit進(jìn)行分析,,可以說對(duì)于使用過AXON設(shè)備的膜片鉗工作者來(lái)說,上手毫無(wú)難度。封接是膜片鉗記錄的關(guān)鍵步驟之一,。美國(guó)單通道膜片鉗研究

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膜片鉗技術(shù)的建立1.拋光及填充好玻璃管微電極,,并將它固定在電極夾持器中。2.通過一個(gè)與電極夾持器連接的導(dǎo)管給微電極內(nèi)一個(gè)壓力,,一直到電極浸入記錄槽溶液中,。3.當(dāng)電極浸沒在溶液中時(shí)給電極一個(gè)測(cè)定脈沖(命令電壓,如5-10ms,,10mV)讀出電流,,按照歐姆定律計(jì)算電阻。4.通過膜片鉗放大器的控制鍵將微電極前列的連接電位(junctionpotentials)調(diào)至零位,,這種電位差是由于電極內(nèi)填充溶液與浸浴液不同離子成分的遷移造成的,。5.用微操縱器將微電極前列在直視下靠近要記錄的細(xì)胞表面,并觀察電流的變化,,直至阻抗達(dá)到1GΩ以上形成"干兆封接"6.調(diào)整靜息膜電位到期望的鉗位電壓的水平,,使放大器從"搜尋"轉(zhuǎn)到"電壓鉗"時(shí)細(xì)胞不至于鉗位到零。日本雙分子層膜片鉗哪家好脂質(zhì)層電導(dǎo)很低,,由于雙分子層的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),,形成了細(xì)胞的膜電容,通道蛋白開閉狀況主要決定了膜電導(dǎo)的數(shù)值,。

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膜片鉗技術(shù)的創(chuàng)立取代了電壓鉗技術(shù),,是細(xì)胞電生理研究的一個(gè)飛躍,使得離子通道的研究,,從宏觀深入到微觀,,使昔日的“肉湯生理學(xué)(brothphysiology)”與“閃電生理學(xué)(lightningphysiology)”在分子水平上結(jié)合起來(lái),,使人們對(duì)膜通道的認(rèn)識(shí)耳目一新,。當(dāng)前,生理學(xué),、生物物理學(xué),、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和藥理學(xué)等多種學(xué)科正在把膜片鉗技術(shù)和膜通道蛋白重組技術(shù),、同位素示蹤技術(shù)和光譜技術(shù)等非電生理技術(shù)結(jié)合起來(lái),,協(xié)同對(duì)離子通道進(jìn)行較全的研究。不少實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)將基因工程與膜片鉗技術(shù)結(jié)合起來(lái),,把通道蛋白有目的地重組于人工膜中進(jìn)行研究,。設(shè)想將合成的通道蛋白分子接種入機(jī)體以替換有缺陷和異常的通道的功能而達(dá)到的目的。

1976年德國(guó)馬普生物物理化學(xué)研究所Neher和Sakmann在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時(shí),,記錄到ACh的單通道離子電流,,從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。1980年Sigworth等在記錄電極內(nèi)施加5-50cmH2O的負(fù)壓吸引,得到10-100GΩ的高阻封接(Giga-seal),,明顯降低了記錄時(shí)的噪聲實(shí)現(xiàn)了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破,。1981年Hamill和Neher等對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn),引進(jìn)了膜片游離技術(shù)和全細(xì)胞記錄技術(shù),,從而使該技術(shù)更趨完善,,具有1pA的電流靈敏度、1μm的空間分辨率和10μs的時(shí)間分辨率,。1983年10月,,《Single-ChannelRecording》一書問世,奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑,。Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻(xiàn),,榮獲1991年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。屯流鉗素向細(xì)胞內(nèi)注入刺激電流,,記錄膜電位對(duì)刺激電流的反應(yīng),。

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電壓鉗的缺點(diǎn)∶電壓鉗技術(shù)目前主要用于巨火細(xì)胞的全細(xì)胞電流研究,特別在分子克隆的卵母細(xì)胞表達(dá)電流的鑒定中發(fā)揮其它技術(shù)不能替代的作用,。但也有其致命的弱點(diǎn)1,、微電極需刺破細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,以致造成細(xì)胞漿流失,,破壞了細(xì)胞生理功能的完整性;2,、不能測(cè)定單一通道電流。因?yàn)殡妷恒Q制的膜面積很大,,包含著大量隨機(jī)開放和關(guān)閉著的通道,,而且背景噪音大,往往掩蓋了單一通道的電流,。3,、對(duì)體積小的細(xì)胞(如哺乳類***元,直徑在10-30μm之間)進(jìn)行電壓鉗實(shí)驗(yàn),,技術(shù)上有更大的困難,。由于電極需插入細(xì)胞,不得不將微電極的前列做得很細(xì),,如此細(xì)的前列致使電極阻抗很大,,常常是60~-8OMΩ或120~150MΩ(取決于不同的充灌液)。這樣大的電極阻抗不利于作細(xì)胞內(nèi)電流鉗或電壓鉗記錄時(shí)在短時(shí)間(0.1μs)內(nèi)向細(xì)胞內(nèi)注入電流,,達(dá)到鉗制膜電壓或膜電流之目的,。再者,在小細(xì)胞上插入的兩根電極可產(chǎn)生電容而降低測(cè)量電壓電極的反應(yīng)能力,。膜片鉗技術(shù)原理膜片鉗技術(shù)是用玻璃微電極接觸細(xì)胞,,形成吉?dú)W姆(GΩ)阻抗,。膜片鉗電壓鉗制

在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時(shí),記錄到ACh啟動(dòng)的單通道離子電流,,從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù),。美國(guó)單通道膜片鉗研究

電壓鉗的原理∶用兩根前列直徑0.5um的電極插入細(xì)胞內(nèi),一根電極用作記錄電極以記錄跨膜電位,,用另一根電極作為電流注入電極,,以固定膜電位。從而實(shí)現(xiàn)固定膜電位的同時(shí)記錄膜電流,。電位記錄電極引導(dǎo)的膜電位(Vm)輸入電壓鉗放大器的負(fù)輸入端,,而人為控制的指令電位(Vc)輸入正輸入端,放大器的正負(fù)輸入端子等電位,,向正輸入端子施加指令電位(Vc)時(shí),,經(jīng)過短路負(fù)端子可使膜片等電較,即Vm=Vc,,從而達(dá)到電位鉗制的目的,,并可維持一定的時(shí)間。Vc的不同變化將導(dǎo)致Vm的變化,,從而引起細(xì)胞膜上電壓依賴性離子通道的開放,,通道開放引起的離子流反過來(lái)又引起Vm的變化,致使Vm≠Vc,,Vc與Vm的任何差值都會(huì)導(dǎo)致放大器有電壓輸出,,將相反極性的電流注入細(xì)胞,以使Vc=Vm,,注入電流的大小與跨膜離子流相等,,但方向相反。因而注入的電流被認(rèn)為是標(biāo)本興奮時(shí)的跨膜電流值(通道電流),。美國(guó)單通道膜片鉗研究

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