在2020年12月22日,，臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告,。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”,。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來即時病理,、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當(dāng)中,；國內(nèi)激光雙光子顯微鏡成像原理

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有100飛秒,，而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦,，提高了熒光檢測效率,。國外ultima雙光子顯微鏡商家對于顯微成像技術(shù)包含：寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡,、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡,、雙光子顯微鏡。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子過期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上,。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多,，首先是便宜，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了,。其次是靈活,，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活,。好處就是可以鍛煉隊伍,，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護(hù)也更加自由,。當(dāng)然壞處也不少,，首先是操心，特別是第1次搭的時候,，開始要想方案,，后來要解決各種實際問題。其次是花時間,，加上買配件的時間,，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長。現(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol,，大多是老外寫的，中文的較少,。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒有經(jīng)驗的時候，容易走彎路,，多花錢,，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,，在國內(nèi)買這些東西耗時較長,。因此，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗,，貼出來分享,，希望能幫到想自己動手的實驗室，

剛好雙光子在這兩點具有很大的優(yōu)勢在實際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大,，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料,，已經(jīng)有做到mm級別的穿透深度HighqualitycellularTPimagingwithhighsignal-to-backgroundratio(>100)andtissueimagingwithapenetrationdepthof2200μmhavebeenachievedwithP-QDasprobe.ExtremelyHighBrightnessfromPolymer-EncapsulatedQuantumDotsforTwo-photonCellularandDeep-tissueImaging:ScientificReports:NaturePublishingGroup雙光子顯微鏡角膜成像。

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率,，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對比,，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521nm，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU,，對直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測試性成像,，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,，模擬計算顯示v2PE點擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率,。雙光子顯微鏡型號有哪些,？國內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡多少錢

雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡成像原理

在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,，來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上,，所以其成像是整個樣品的重疊像，沒有縱向分辨能力,。單光子激光共聚焦顯微鏡用針空有效濾除了雜散光,，分辨率有了本質(zhì)上的提高，擁有了對樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力,，可以進(jìn)行三維成像,、動態(tài)成像等。然而,，針空在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,，只有很弱的熒光到達(dá)檢測器。若要提高信號強(qiáng)度,，需要加大激發(fā)光功率,，這又會導(dǎo)致對活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡蕞大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),，與單光子共聚焦顯微鏡蕞大的不同在于無須使用針空限制光學(xué)散射,，其具體優(yōu)勢如下所述。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡成像原理