功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展使研究腦區(qū)和神經(jīng)元的內(nèi)部工作成為可能,。隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展,，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細胞內(nèi)游離鈣離子濃度,，以此表示細胞的功能狀態(tài),。目前它被廣泛應(yīng)用于實時監(jiān)測一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，從而判斷其功能活動,。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時間和空間上的傳遞穿梭,。鈣離子在很多生理活動中都發(fā)揮著重要作用。上海特殊鈣成像維修電話

鈣成像具有以下幾個優(yōu)勢：1.非侵入性：鈣成像技術(shù)可以在活物細胞或組織中進行觀察,，無需破壞細胞或組織的完整性,，因此是一種非侵入性的技術(shù)。2.高時空分辨率：鈣成像技術(shù)可以實時觀察細胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)變化,，具有較高的時空分辨率,。可以捕捉到鈣離子濃度的瞬時變化,，揭示細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的快速過程,。3.多樣性：鈣成像技術(shù)可以使用不同的熒光探針或基因工程技術(shù)，實現(xiàn)對不同類型的細胞或組織進行鈣成像,?？梢愿鶕?jù)需要選擇適合的探針或方法，擴展應(yīng)用范圍,。4.可定量分析：通過鈣成像技術(shù)可以獲得熒光信號的強度,，可以進行定量分析，了解鈣離子濃度的變化程度,。可以通過比較不同條件下的鈣成像結(jié)果,，研究因素對鈣離子信號的調(diào)控作用,。5.可應(yīng)用于多個領(lǐng)域：鈣成像技術(shù)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、細胞生物學(xué),、藥理學(xué)等領(lǐng)域,。可以研究神經(jīng)元活動,、細胞信號傳導(dǎo),、細胞凋亡等生物過程，有助于揭示生物學(xué)機制和疾病發(fā)生及發(fā)展的過程,。綜上所述,，鈣成像技術(shù)具有非侵入性、高時空分辨率,、多樣性,、可定量分析和廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域等優(yōu)勢，成為研究細胞內(nèi)鈣離子動態(tài)變化的重要工具,。寧波光遺傳鈣成像nVista鈣離子也是神經(jīng)元活動的重要“風(fēng)向標(biāo)”之一,。

傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡由于光散射的影響,，只能夠?qū)Υ竽X淺層的神經(jīng)元或在離體組織上進行成像，共聚焦顯微鏡由于光損傷較大,，一般也只用于離體鈣成像,。隨著熒光顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展，在體鈣成像技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展,。雙光子熒光顯微鏡能夠在進行在體成像的時候?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高信噪比,。例如，用雙光子顯微鏡對海馬樹突棘的鈣離子信號進行成像,，研究神經(jīng)元突觸后長時程降低(Wangetal.,2000),；觀察在體小鼠運動皮層神經(jīng)元在嗅覺選擇任務(wù)中刺激相關(guān)電位(Komiyamaetal.,2010)等等。不過,，這些實驗還是需要對動物進行麻醉和固定,，而神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域很多研究更希望能夠?qū)ψ杂苫顒拥膭游镞M行研究。近年來出現(xiàn)了通過植入性的microscope或microlens進行在體freelymoving動物鈣成像的技術(shù),。使用一端帶有GRINlens的光纖連接顯微鏡和動物大腦,，從特定腦區(qū)發(fā)出的熒光信號被光纖收集，然后通過Inscopix顯微鏡成像,。動物頭部只需植入GRINlens,，方便活動。

可見光激發(fā)Ca2+熒光探針：與紫外光激發(fā)探針相比,，可見光激發(fā)Ca2+探針具有更強的染料吸收性能,，對Ca2+變化水平檢測敏感度也更高，能夠降低對活細胞的光毒性和樣品自發(fā)熒光以及光散射的干擾,，且無光譜偏移,。較常使用的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針有Fluo-3，F(xiàn)luo-4,，Rhod-2等,，同時他們也都是非比率型指示劑。Fluo-3是較常用的可見光激發(fā)Ca2+熒光指示劑之一,，是典型的的單波長指示劑,，比較大激發(fā)波長為506nm，比較大發(fā)射波長為526nm,。它與Ca2+結(jié)合之前幾乎無熒光,，結(jié)合后熒光會增加60至100倍，從而避免了細胞自身的熒光干擾,。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右,，發(fā)射波長為525～530nm（圖3）。Fluo-3可以用在激光共聚焦顯微成像或流式細胞儀中。它還有一個升級版本Fluo-4,，在相同Ca2+濃度下信號更強,。小鼠頭戴式微型顯微鏡為后續(xù)清醒動物腦功能鈣成像研究提供了一套可靠的顯微成像系統(tǒng)。

目前可用的指示劑較多,，根據(jù)熒光光譜,、與鈣離子親和力及其化學(xué)特性的不同大致分為化學(xué)性鈣離子指示劑和基因編碼鈣離子指示劑。前者指可特異性與鈣離子結(jié)合的小分子,，常用的有fura-2,、indo-1等；而后者主要指來源于綠色熒光蛋白GFP及其變異體的蛋白質(zhì),，可與鈣調(diào)蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶M13域結(jié)合,，常用的有GCaMP、TN-XXL等,，其中GCaMP5G和GCaMP6被廣泛應(yīng)用于在體鈣成像研究中,。生物熒光蛋白：Aequorin是水母熒光素（coelenterazine）通過硫酸酯鍵或過氧化鍵緊緊連到脫輔水母發(fā)光蛋白上形成的，遇到鈣離子就發(fā)出470nm藍光,，可以作為鈣離子的檢測試劑,；化學(xué)鈣離子指示劑：Fura-2可在紫外光下被jihuo且發(fā)射出505-520nm光；基于FRET的基因編碼的鈣指示劑,；單個熒光基因編碼的鈣指示劑,。鈣成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)鈣離子產(chǎn)生各種各樣的胞內(nèi)信號。上海特殊鈣成像維修電話

功能鈣成像技術(shù)是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來,，通過熒光染料信號的改變反映細,。上海特殊鈣成像維修電話

包含鈣離子指示劑的細胞可以通過熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)觀測，然后通過CCD攝像機捕捉,、記錄圖像?，F(xiàn)在鈣成像技術(shù)主要在以下幾類神經(jīng)科學(xué)研究方面有廣泛應(yīng)用：1.記錄培養(yǎng)的神經(jīng)元的活動。2.記錄腦片上神經(jīng)元的活動,。記錄神經(jīng)元的活動。由于離體實驗本身的限制,，現(xiàn)在越來越多的神經(jīng)方面科學(xué)家傾向于做在體鈣成像實驗,，希望能得到更準(zhǔn)確且更能反應(yīng)生理狀況的數(shù)據(jù)。得益于雙光子熒光顯微鏡的發(fā)展,，現(xiàn)在在實驗動物處于huoti狀態(tài)下的鈣成像技術(shù)取得了飛速進展,。4.記錄神經(jīng)元樹突和樹突棘（spine）的活動。由于對于實驗精度的要求,，有些科學(xué)家不僅只想記錄單個神經(jīng)元的反應(yīng),，他們還想更確切地知道神經(jīng)元上哪些樹突和樹突棘參與了某個行為，也就是說他們需要在huoti條件下，對單根樹突以及某些spine進行鈣成像記錄實驗,。由于雙光子熒光顯微鏡和GCaMP6基因編碼鈣離子指示劑的發(fā)展,，現(xiàn)在，對樹突和樹突棘用鈣成像實驗進行記錄也成為了可能,。上海特殊鈣成像維修電話