傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡由于光散射的影響,，只能夠?qū)Υ竽X淺層的神經(jīng)元或在離體組織上進(jìn)行成像,，共聚焦顯微鏡由于光損傷較大,，一般也只用于離體鈣成像。隨著熒光顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展,，在體鈣成像技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展,。雙光子熒光顯微鏡能夠在進(jìn)行活動動物成像的時候?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高信噪比。例如,，用雙光子顯微鏡對海馬樹突棘的鈣離子信號進(jìn)行成像,，研究神經(jīng)元突觸后長時程yizhi(Wangetal.,2000)；觀察活動小鼠運動皮層神經(jīng)元在嗅覺選擇任務(wù)中刺激相關(guān)電位(Komiyamaetal.,2010)等等,。不過,，這些實驗還是需要對動物進(jìn)行麻醉和固定，而神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域很多研究更希望能夠?qū)ψ杂苫顒拥膭游镞M(jìn)行研究,。鈣離子在很多生理活動中都發(fā)揮著重要作用,。上海細(xì)胞鈣離子鈣成像nVoke

科學(xué)家利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動。隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展,，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況,。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，以此daibiao細(xì)胞的功能狀態(tài),。目前它被廣泛應(yīng)用于實時監(jiān)測一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化,，從而判斷其功能活動。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時間和空間上的傳遞穿梭,。哈爾濱inscopix鈣成像口碑好傳統(tǒng)鈣成像實驗要求成像的光路極為穩(wěn)定,。

可見光激發(fā)Ca2+熒光探針：與紫外光激發(fā)探針相比,，可見光激發(fā)Ca2+探針具有更強的染料吸收性能,，對Ca2+變化水平檢測敏感度也更高，能夠降低對活細(xì)胞的光毒性和樣品自發(fā)熒光以及光散射的干擾,，且無光譜偏移,。較常使用的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針有Fluo-3，F(xiàn)luo-4,，Rhod-2等,，同時他們也都是非比率型指示劑。Fluo-3是較常用的可見光激發(fā)Ca2+熒光指示劑之一,，是典型的的單波長指示劑,，比較大激發(fā)波長為506nm，比較大發(fā)射波長為526nm,。它與Ca2+結(jié)合之前幾乎無熒光,，結(jié)合后熒光會增加60至100倍，從而避免了細(xì)胞自身的熒光干擾,。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右,，發(fā)射波長為525～530nm（圖3）。Fluo-3可以用在激光共聚焦顯微成像或流式細(xì)胞儀中,。它還有一個升級版本Fluo-4,，在相同Ca2+濃度下信號更強。

鈣離子成像系統(tǒng)：傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡由于光散射的影響,，只能夠?qū)Υ竽X淺層的神經(jīng)元或在離體組織上進(jìn)行成像,，共聚焦顯微鏡由于光損傷較大，一般也只用于離體鈣成像,。隨著熒光顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展,，在體鈣成像技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展。雙光子熒光顯微鏡能夠在進(jìn)行成像的時候?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高信噪比,。例如,，用雙光子顯微鏡對海馬樹突棘的鈣離子信號進(jìn)行成像，研究神經(jīng)元突觸后長時程控制(Wangetal.,2000),；觀察小鼠運動皮層神經(jīng)元在嗅覺選擇任務(wù)中刺激相關(guān)電位(Komiyamaetal.,2010)等等,。不過，這些實驗還是需要對動物進(jìn)行麻醉和固定，而神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域很多研究更希望能夠?qū)ψ杂苫顒拥膭游镞M(jìn)行研究,。近年來出現(xiàn)了通過植入性的microscope或microlens進(jìn)行freelymoving動物鈣成像的技術(shù),。如圖6中所示的光纖成像法：使用一端帶有GRINlens的光纖連接顯微鏡和動物大腦，從特定腦區(qū)發(fā)出的熒光信號被光纖收集,，然后通過相機(jī)成像,。動物頭部只需植入GRINlens，方便活動,，而且可以同時植入多個lens來觀察不同的腦區(qū)之間的聯(lián)系和相互作用,。不過這種成像方法的視野較小，分辨率也比較差,。多種鈣離子指示劑和鈣成像手段的存在使研究人員能夠根據(jù)具體的實驗需要進(jìn)行選擇,。

大家都知道，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性,，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,，其中包括電壓門控鈣離子通道,、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等,。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來,，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞,。鈣成像技術(shù)（calcium imaging）是指利用鈣離子指示劑或指示監(jiān)測組織內(nèi)鈣離子濃度的方法,。重慶熒光顯微鈣成像grain lens

鈣成像技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用。上海細(xì)胞鈣離子鈣成像nVoke

對于雙光子（2P）鈣成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個大的深度限制因素,，而對于三光子成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號,。功能性三光子顯微鏡比結(jié)構(gòu)性三光子顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描,，以便及時采樣神經(jīng)元活動,；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號,。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來,，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布guangfan的神經(jīng)元的活動,，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué)，就需要MPM具備對神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力,?？焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)上海細(xì)胞鈣離子鈣成像nVoke