多光子顯微鏡因擁有較深的成像深度,，和較高的對比度在生物成像中有著重要的意義,，但是它通常需要較高的功率。結(jié)合時(shí)間上展開的超短脈沖可以實(shí)現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度,，但是其本身所利用的近紅外波段的光會導(dǎo)致分辨率較低,。清華大學(xué)陳宏偉教授和北京大學(xué)席鵬研究員合作研究，結(jié)合了結(jié)構(gòu)光成像和上轉(zhuǎn)化粒子,，開發(fā)了一種基于多光子上轉(zhuǎn)化材料和時(shí)間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM),。它可以實(shí)現(xiàn)50MHz的超高的掃描速度，并突破了衍射極限,，實(shí)現(xiàn)了超分辨成像,。相較于普通的熒光顯微鏡，該顯微鏡提升了,，并且只需要較低的激發(fā)功率,。這種超快、低功率、多光子的超分辨技術(shù),，在分辨率高的生物深層組織成像上有著長遠(yuǎn)的應(yīng)用前景,。中國市場多光子顯微鏡進(jìn)出口貿(mào)易趨勢。布魯克多光子顯微鏡單分子成像定位

2020年,，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置,，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦,，會聚角為Δθ,。光束進(jìn)入到一對幾乎平行的高反射鏡中,，其間距為S,，偏角為α。經(jīng)過反射鏡多次反射后,，激光脈沖被分成多個(gè)傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α）,，脈沖間以2S/c的時(shí)間延遲（c，光速）回射,。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時(shí)間間隔為2ns,。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點(diǎn)越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。清醒動物多光子顯微鏡數(shù)據(jù)處理多光子顯微鏡可以進(jìn)行深層成像，且具有三維成像的能力,，可以應(yīng)用于拍攝不透明的厚樣品,。

在生物成像中，我司多光子顯微鏡具有清晰,，快速,，深層，活這四個(gè)方面,。結(jié)合了多光子上轉(zhuǎn)化材料以及時(shí)間編碼的結(jié)構(gòu)光超分辨技術(shù),，實(shí)現(xiàn)了快速（50MHz的掃描速度），超分辨（超衍射極限）成像。作為一種新的高速,，超高分辨率的成像系統(tǒng),，MUTE-SIM可以幫助我們對快速運(yùn)動的生物圖像進(jìn)行分辨率高的成像。盡管關(guān)于深度成像的應(yīng)用我們沒有進(jìn)一步展示,，但是結(jié)合1560nm近紅外光相對于可見光更佳的穿透性,，我們相信該技術(shù)將有利于對生物組織進(jìn)行高速，超分辨,，高深度地成像,，有助于生物影像學(xué)的發(fā)展。滔博生物TOP-Bright是一家集研發(fā),，生產(chǎn),，銷售于一體的專注于神經(jīng)科學(xué)產(chǎn)品及致力于向高校、科研機(jī)構(gòu)等領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)室一體化方案的高科技企業(yè),。業(yè)務(wù)服務(wù)范圍已遍布至全國各地幾百家實(shí)驗(yàn)室,。目前公司主營產(chǎn)品是享譽(yù)全球的國際品牌和產(chǎn)品,這些儀器設(shè)備都是科學(xué)研究所必備且不可替代的基礎(chǔ)儀器。

針對雙光子熒光顯微鏡的特點(diǎn),，從理論上分析雙光子成像特點(diǎn),，并搭建一套時(shí)間、空間分辨率高,，能實(shí)時(shí),、動態(tài)、多參數(shù)測量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng),。具體系統(tǒng)應(yīng)實(shí)現(xiàn)∶（1）能對不同染料的雙光子熒光進(jìn)行探測;（2）用特定染料對樣品標(biāo)記以后,，能實(shí)現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過實(shí)驗(yàn)的研究，改進(jìn)雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質(zhì)量的前提下,，簡化整個(gè)系統(tǒng),，使得實(shí)驗(yàn)操作方便、安全,。單光子激發(fā)熒光的過程,，就是熒光分子吸收一個(gè)光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),，躍遷以后,，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子,，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級,。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級像在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢。而在顯微成像中,，雙光子熒光顯微鏡憑其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn),，成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能檢測的重要工具,。多光子顯微鏡的發(fā)展歷史充滿了貢獻(xiàn)、開發(fā),、進(jìn)步和數(shù)個(gè)世紀(jì)以來多個(gè)來源和地點(diǎn)的改進(jìn),。

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2],。在光學(xué)顯微鏡中,，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度。近年來,，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡（ETL）已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描,；但是，遠(yuǎn)程聚焦中反射鏡的機(jī)械驅(qū)動會限制軸向掃描速度,，ETL會引入球面像差和更高階像差,，從而無法進(jìn)行高分辨率成像。為了克服這些局限性,，該組引入了一種新穎的光學(xué)設(shè)計(jì),，能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無球差的軸向掃描。該設(shè)計(jì)有兩種實(shí)現(xiàn)方式,，第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描，另一種能夠進(jìn)行連續(xù)的軸向掃描,。具體裝置如圖3a所示,，由兩個(gè)垂直臂組成，每個(gè)臂中都有一個(gè)4F望遠(yuǎn)鏡和一個(gè)物鏡,。遠(yuǎn)程聚焦臂包含一個(gè)檢流掃描鏡（GSM）和一個(gè)空氣物鏡（OBJ1）,，另一個(gè)臂（稱為照明臂）由一個(gè)水浸物鏡（OBJ2）構(gòu)成。將這兩個(gè)臂對齊,，以使GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛,。準(zhǔn)直的激光束被偏振分束器反射到遠(yuǎn)程聚焦臂中，GSM對其進(jìn)行掃描,，進(jìn)而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)進(jìn)行橫向掃描,。多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu),。美國嚙齒類多光子顯微鏡方案

顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡,。布魯克多光子顯微鏡單分子成像定位

首代小型化雙光子顯微鏡在國際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經(jīng)元和突觸的動態(tài)圖像后，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡,。它具有更大的成像視野和三維成像能力,，可以清晰穩(wěn)定地對自由活動小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行成像，實(shí)現(xiàn)對同一批神經(jīng)元的一個(gè)月追蹤記錄,。通過對微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì)系統(tǒng)的,。微物鏡工作距離延長至1mm，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)成像。內(nèi)嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊,，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像,。該掃描模塊由一個(gè)快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時(shí)可保持放大倍率恒定,。其變焦模塊重量,，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由拆卸。此外,，新版微型化成像探頭可整體即時(shí)拔插,，極大地簡化了實(shí)驗(yàn)操作，避免了長周期實(shí)驗(yàn)時(shí)對動物的干擾,。在重復(fù)裝卸探頭同一批神經(jīng)元時(shí),，視場旋轉(zhuǎn)角小于，邊界偏差小于35微米,。布魯克多光子顯微鏡單分子成像定位