EndoS糖苷內(nèi)切酶S在抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）研究中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在糖鏈定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)上,。通過上海藥物所的研究，開發(fā)了一種新穎的糖鏈定點(diǎn)ADC制備策略,，利用EndoS2這種糖苷內(nèi)切酶,，可以將小分子細(xì)胞毒藥物“一步”定點(diǎn)連接到抗體的糖基化位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了糖鏈定點(diǎn)ADC化合物的制備,。定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)相比傳統(tǒng)的隨機(jī)偶聯(lián)具有更好的方法指數(shù),，能夠提高ADC的均一性和穩(wěn)定性，是當(dāng)前ADC領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,。在抗體的Fc結(jié)構(gòu)域N297位,，這是一個(gè)保守的糖基化位點(diǎn)，通過在該位點(diǎn)引入細(xì)胞物質(zhì),，可以形成具有優(yōu)勢(shì)的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物（glycosite-specificADCs,gsADCs）,。此外，EndoS2對(duì)多樣化的LacNAc修飾顯示出良好的兼容性,，能夠高效獲得功能修飾的糖工程抗體,，并且可以用于抗體的內(nèi)吞成像研究及糖鏈延伸等功能化研究。研究人員通過這種“一步”制備策略得到的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物，在結(jié)構(gòu)均一性,、親水性,、體外穩(wěn)定性以及體外活性方面表現(xiàn)良好，并且在體內(nèi)瘤抑制活性方面,，相比陽性對(duì)照ADC化合物,，在低載藥量的情況下具有更強(qiáng)的抑制效果。EndoS酶的這些應(yīng)用,，不僅展示了其在簡(jiǎn)化ADC制備流程中的潛力,，還有助于推動(dòng)定點(diǎn)ADC藥物的深入發(fā)展，為未來的生物藥物開發(fā)提供了新的思路和方法,。Multiplex Probe qPCR Mix 是一種濃縮預(yù)混液,，含有抗體技術(shù)修飾的熱啟動(dòng)酶Hotstart Taq DNA聚合酶。Recombinant Human Annexin V/ANXA5 Protein,Tag Tag

通過EndoS糖苷內(nèi)切酶S進(jìn)行糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)分析通常涉及以下步驟：1.**樣本準(zhǔn)備**：首先,，需要獲得糖蛋白的純化樣本,，以確保分析的準(zhǔn)確性。2.**酶的準(zhǔn)備**：準(zhǔn)備適量的EndoS糖苷內(nèi)切酶S,，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的濃度和緩沖體系,。3.**酶切反應(yīng)**：-將糖蛋白樣本與EndoS酶混合，在適宜的條件下（如pH,、溫度等）進(jìn)行酶切反應(yīng),。-反應(yīng)時(shí)間根據(jù)EndoS的活性和所需的切割程度來確定。4.**終止反應(yīng)**：在達(dá)到預(yù)期的酶切時(shí)間后,，通過加熱或添加適當(dāng)?shù)木彌_液來終止酶切反應(yīng),。5.**分離純化**：-使用色譜技術(shù)（如凝膠滲透色譜、離子交換色譜等）將酶切后的糖蛋白和釋放的糖鏈分離,。-純化過程可能需要多步色譜以確保糖鏈的純度,。6.**糖鏈分析**：-對(duì)分離得到的糖鏈進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析，可能包括質(zhì)譜分析,、核磁共振（NMR）波譜分析等,。-可以使用高分辨率的質(zhì)譜技術(shù)，如MALDI-TOF或ESI-MS,，來確定糖鏈的精確質(zhì)量,。7.**序列鑒定**：通過與已知糖鏈數(shù)據(jù)庫比對(duì)，確定糖鏈的序列和結(jié)構(gòu),。8.**功能分析**：研究酶切后的糖蛋白和釋放的糖鏈對(duì)生物活性的影響,，如結(jié)合特性,、免疫原性等。9.**數(shù)據(jù)分析**：收集所有數(shù)據(jù)并進(jìn)行綜合分析，以揭示糖鏈結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系,。

PreScissionProtease（PSP）是一種由人鼻病毒14型的3C蛋白酶（humanrhinovirus(HRV)type143Cprotease）和GST組成的融合蛋白。它具有以下特點(diǎn)：1.**特異性識(shí)別**：PreScissionProtease能在低溫下（4°C）特異識(shí)別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro,，并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切。2.**依賴結(jié)構(gòu)**：底物的識(shí)別和切割不僅依賴于融合蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu),，還依賴于融合蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu),。3.**分離GST標(biāo)簽**：它可以特異性的將pGEX-6P系列等載體表達(dá)出的帶有酶底物識(shí)別多肽序列融合蛋白的GST標(biāo)簽進(jìn)行分離。4.**表達(dá)宿主**：本品由大腸桿菌中重組表達(dá),，并以無菌液體形式提供,。5.**物理性質(zhì)**：分子量約為46kDa，物理外觀為無菌無色液體,。6.**儲(chǔ)存緩沖液**：25mMTris-HCl（pH8.0）,，150mMNaCl，1mMEDTA,，5mMDTT,，50%（V/V）Glycerin,。7.**酶切緩沖液**：10×酶切緩沖液為500mMTris-HCl（pH7.0）,，1.5MNaCl，10mMEDTA,，10mMDTT,。8.**純度**：經(jīng)SDS-PAGE及HPLC分析，純度大于95%,。9.**酶活定義**：在5℃條件下反應(yīng)16小時(shí),，能夠切割10μg的GST標(biāo)簽的融合蛋白達(dá)90%以上所需的酶量定義為一個(gè)活性單位。

重組人血清白蛋白（rHSA）在藥物載體應(yīng)用中提高藥物穩(wěn)定性和靶向性的機(jī)制主要包括以下幾點(diǎn)：1.**延長(zhǎng)半衰期**：通過與rHSA融合,，可以延長(zhǎng)藥物分子在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,。例如，阿必魯肽（Tanzeum）是GLP-1與HSA的融合蛋白,，其半衰期可延長(zhǎng)至5天,，每周給藥一次即可。2.**提高穩(wěn)定性**：rHSA作為載體,，可以保護(hù)藥物分子不受體內(nèi)酶解和其他降解因素的破壞,，從而提高藥物的穩(wěn)定性。例如,，F(xiàn)GF21與HSA融合后,，其體外穩(wěn)定性提升，抗胰蛋白酶降解能力和高溫條件下的穩(wěn)定性增加,。3.**改善藥代動(dòng)力學(xué)**：rHSA融合蛋白能夠改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特性,，如改變藥物的分布和代謝，減少腎臟的損失，從而提高藥物在體內(nèi)的濃度和療效,。4.**增強(qiáng)靶向性**：rHSA可以通過其天然的生物學(xué)特性,，如與特定受體的結(jié)合，增強(qiáng)藥物對(duì)特定組織或細(xì)胞的靶向性,。例如,，rHSA可以通過其與FcRn受體的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)瘤組織的靶向性,。5.**降低免疫原性**：rHSA作為一種內(nèi)源性蛋白質(zhì),，具有較低的免疫原性，可以減少藥物引起的免疫反應(yīng),，提高藥物的安全性和耐受性,。Cas12a同源物能夠識(shí)別更簡(jiǎn)單的PAM序列（如5-TTN），這使得基因組的覆蓋率顯著提高,。

NLS-Cas9-EGFPNuclease在基因編輯中提高特異性的策略包括：1.**核定位信號(hào)（NLS）**：NLS有助于Cas9蛋白快速定位到細(xì)胞核,，這可以減少Cas9在細(xì)胞質(zhì)中的非特異性結(jié)合，從而降低脫靶效應(yīng),。2.**瞬時(shí)表達(dá)**：由于NLS-Cas9-EGFPNuclease是作為蛋白質(zhì)直接遞送的,，它在細(xì)胞內(nèi)不會(huì)經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)，這限制了Cas9的活性時(shí)間窗口,，減少了長(zhǎng)時(shí)間存在導(dǎo)致的脫靶風(fēng)險(xiǎn),。3.**優(yōu)化gRNA設(shè)計(jì)**：精心設(shè)計(jì)的gRNA可以提高特異性，通過選擇與目標(biāo)基因特異性匹配的gRNA,，可以減少Cas9在非目標(biāo)位點(diǎn)的切割,。4.**使用高保真Cas9變體**：一些Cas9變體被設(shè)計(jì)為具有更高的特異性，通過突變Cas9蛋白的某些氨基酸,，可以降低其在非目標(biāo)位點(diǎn)的活性,。5.**熒光標(biāo)記（EGFP）**：EGFP標(biāo)簽不僅用于追蹤和分選，還可以幫助研究者通過熒光激起細(xì)胞分選（FACS）富集成功編輯的細(xì)胞,，從而提高編輯特異性,。6.**體外驗(yàn)證**：在實(shí)際進(jìn)行體內(nèi)基因編輯之前，可以通過體外DNA切割實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證gRNA的特異性和效率,，篩選出比較好的gRNA,。7.**使用PAM序列優(yōu)化**：通過選擇具有限制性PAM序列的gRNA，可以減少可能的脫靶位點(diǎn),。

在泛素化過程中,，首先泛素激起酶E1（Uba1或其他）在ATP的存在下激起泛素分子,，形成E1-泛素硫酯中間體,。Recombinant Human Annexin V/ANXA5 Protein,Tag Tag

使用PreScissionProtease進(jìn)行蛋白質(zhì)切割后，可以采用以下方法來提高產(chǎn)品的純度：1.**親和層析**：利用GST標(biāo)簽或His標(biāo)簽等進(jìn)行一步或多步親和層析,，以高純度分離目的蛋白,。2.**離子交換層析**：根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷特性，使用陽離子或陰離子交換層析進(jìn)一步純化蛋白質(zhì),。3.**凝膠滲透層析**：通過分子大小的排阻,，去除分子量較大或較小的雜質(zhì)。4.**反向?qū)游?*：使用反相高效液相色譜（HPLC）技術(shù),，根據(jù)蛋白質(zhì)與固定相的疏水相互作用進(jìn)行分離,。5.**超濾/透析**：使用超濾膜或透析袋去除低分子量的雜質(zhì)，如鹽分,、緩沖液成分或小分子蛋白質(zhì),。6.**二次親和層析**：在初次親和層析后，可以進(jìn)行二次親和層析以進(jìn)一步提高純度,。7.**蛋白質(zhì)純化柱**：使用商業(yè)化的蛋白質(zhì)純化柱,，如GST-Sepharose或Ni-NTA柱，進(jìn)行快速純化,。8.**等電聚焦電泳**：通過等電聚焦電泳（IEF）分離具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì),。9.**SDS-PAGE**：使用SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白質(zhì)的純度，并可通過凝膠切片回收相對(duì)純凈的蛋白質(zhì)條帶,。10.**質(zhì)譜分析**：利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)的確切質(zhì)量和序列來確保蛋白質(zhì)的純度和正確性,。Recombinant Human Annexin V/ANXA5 Protein,Tag Tag