全基因組甲基化測序(WholeGenomeBisulfiteSequencing,WGBS)是結(jié)合重亞硫酸鹽Bisulfite處理和高通量測序，對有參考基因組進行全基因組的單堿基分辨率的甲基化檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”方案,，***用于人,、哺乳動物及農(nóng)林牧漁方向的高水平甲基化研究。WGBS滿足全基因組DNA甲基化圖譜及疾病關(guān)聯(lián)分析,、基因調(diào)控分析,、疾病的甲基化標(biāo)志物篩選等探索性課題的研究。靈長類早期著床前胚胎發(fā)育中的DNA甲基化重編程研究——(團隊成員發(fā)表).(IF=)靈長類胚胎發(fā)生的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控需要DNA甲基化重編程,。我們首先建立了基于轉(zhuǎn)座酶的超微量WGBS測序技術(shù),，詳細(xì)研究了獼猴早期著床前胚胎7個階段(Sperm、Oocytes,、Zygotes,、2-cell、8-cell,、Morula和ICM)的DNA甲基化動態(tài)變化過程。******闡明了DNA甲基化動力學(xué)的“盈與虧”階段特征,，并通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺失實驗表明DNA甲基化影響早期猴胚胎發(fā)育,。 基于高通量測序平臺的甲基化圖譜分析。重慶6mA技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢

    芯片平臺作為目前比較成熟的篩選工具,，已經(jīng)在很多領(lǐng)域有了相應(yīng)的應(yīng)用,。多家芯片公司在DNA甲基化這塊兒有了相應(yīng)的產(chǎn)品提供，其中應(yīng)用**為***的就Agilent平臺和Illumina平臺,，相應(yīng)的產(chǎn)品包括AgilentHumanCpGIslandMicroarrayKit,，InfiniumHumanMethylation27BeadChip和InfiniumHumanMethylation450KBeadChip。另外RocheNimbleGen和Affymetrix也有相應(yīng)的芯片推出,，但是NimbleGen的芯片今年下半年已經(jīng)停產(chǎn),。不同的芯片平臺，各自的實驗過程也是不一樣的,。安捷倫前期采用的甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術(shù),。將基因組DNA分成兩份，一份用來做MeDIP,，另一份作為對照,。兩個樣品都標(biāo)記熒光(富集的樣品用Cy5標(biāo)記，對照用Cy3標(biāo)記),，然后與芯片雜交,。芯片上每個探針的Cy5/Cy3強度比例顯示出該區(qū)域的甲基化程度,。 江蘇hMeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)活動提供樣本DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果。

    DNA羥甲基化(5hmC)是被認(rèn)為是哺乳動物基因組上的第六堿基,。Bisulfite-Seq并不能區(qū)分甲基化(5mC)和羥甲基化(5hmC),，實際上是5mC和5hmC兩種修飾的混合信號，而通過氧化亞硫酸鹽測序(oxidativebisulfitesequencing,oxBS-Seq),，先將5hmC氧化為甲?；揎?5fC)，進而被亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換為堿基U,，實現(xiàn)DNA甲基化的精細(xì)檢測,。而同時對樣本進行BS-Seq和oxBS-Seq測序則可實現(xiàn)對5hmC全基因組，單堿基分辨率的檢測,，是羥甲基化檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方案,。(12):1730-1741.(IF=)作者利用全基因組氧化-亞硫酸鹽測序(WGBS/oxWGBS)得到了肝臟和肺以及配對**組織的全基因組DNA甲基化和羥甲基化圖譜。在活躍的基因中,，5hmC在CpGIslandshore中呈***富集狀態(tài),，而在CpGIsland中則呈稀缺狀態(tài)。對啟動子,、基因體和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的羥甲基化分析,，羥甲基化與基因表達有很強的正相關(guān)，這表明5hmC是活躍基因的標(biāo)記,，并且可以在由DNA去甲基化調(diào)節(jié)的基因表達中發(fā)揮作用,。

亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)

這種方法一度被認(rèn)為是DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)。它的過程如下：經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后,，設(shè)計引物進行PCR擴增目的片段,，并對PCR產(chǎn)物進行克隆測序，將序列與未經(jīng)處理的序列進行比較,，判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化,。這種方法可靠，且精確度高,，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態(tài),，但因為涉及到測序，其結(jié)果準(zhǔn)確但要求克隆時所挑克隆較多,，操作繁瑣,，不易大批量操作。另外,，甲基化程度的定量依賴于挑選克隆的數(shù)目,，因此這種方法只能算得上是一種半定量的技術(shù)方法。

目前一般會先用BSP找到甲基化位點,，然后根據(jù)甲基化位點設(shè)計MSP引物,，進行相應(yīng)PCR條件摸索,，以用于大量樣本的篩選。 細(xì)胞,、全血,、組織樣本干冰運輸。

    DNA甲基化（DNAmethylation）是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化下,，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基上的化學(xué)修飾過程。哺乳動物基因組中,，DNA甲基化多發(fā)生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子,。DNA甲基化是一種表觀（epigenetic）修飾，它在不改變DNA序列的情況下,，對個體的生長,、發(fā)育、基因表達模式以及基因組的穩(wěn)定性起到重要的調(diào)控作用,，這種修飾是可逆的,，并且這種修飾在發(fā)育和細(xì)胞增殖的過程中是可以穩(wěn)定傳遞的。近年來的大量研究表明,，DNA異常甲基化與**的發(fā)生,、發(fā)展、細(xì)胞*變有著密切的聯(lián)系,。DNA甲基化在**中的作用主要表現(xiàn)在以下幾個方面：一是甲基化的CpG島二核苷酸中的胞嘧啶以較高的頻率脫氨基變成胸腺嘧啶,，造成堿基突變；二是抑*基因和DNA修復(fù)基因由于超甲基化而沉默,；三是*基因甲基化水平降低而活化；四是基因組總體甲基化水平降低使轉(zhuǎn)座子,、重復(fù)序列活化導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降,。這些因素是導(dǎo)致**發(fā)展、轉(zhuǎn)移,、惡化**終導(dǎo)致患者死亡的重要原因,。其中后三個方面源于甲基化水平的改變，而甲基化的過程是可逆的,，因此可以甲基化位點為靶點,，靶向用藥進行**的預(yù)防、***,。 甲基化驗證是甲基化研究必不可少的一環(huán),。重慶6mA技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢

重亞硫酸鹽處理結(jié)合測序是目前檢測甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)。重慶6mA技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢

甲基化特異性PCR（MS-PCR）

DNA在亞硫酸氫鹽作用后,，DNA CpG若無甲基化,，則序列中的C改變?yōu)閁,，若有甲基化則保持不變，因此從理論上講,，用不同的引物做PCR,，即可檢測出這種差異，從而確定基因有無CpG島甲基化,。因此根據(jù)目的基因修飾前后的改變,，就可以相應(yīng)設(shè)計M和U引物，有時我們需要設(shè)計兩輪引物,。

這種方法靈敏度高,，無需特殊儀器，因此經(jīng)濟實用,，是目前應(yīng)用**為***的檢測方法,。不過也存在一定的局限性，預(yù)先需要知道待測片段的DNA序列,，引物的設(shè)計非常重要,。另外，亞硫酸氫鹽處理也十分關(guān)鍵,，若處理不完全則可能導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn),。 重慶6mA技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢