亞硫酸鹽結(jié)合測序是DNA甲基化檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”方案,。除了全基因組甲基化測序等研究手段,，對于目標(biāo)基因/位點檢測或者轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究來說，需要靈活的靶向甲基化測序方案,。BSP(BisulfiteSequencingPCR)結(jié)合高通量測序的TargetBisulfiteSequencing滿足幾個到上百個基因/位點的驗證需求,具有高通量,、低成本的優(yōu)勢,***用于臨床大樣本多位點的甲基化biomarker篩選及高水平文章甲基化驗證環(huán)節(jié)。微生物定植對腸道免疫和代謝相關(guān)基因DNA甲基化的影響——團隊成員發(fā)表.(IF=)我們以早產(chǎn)幼豬為模型,，利用RRBS測序比較正常(n=7)和口服***(n=7)的腸道DNA甲基化差異,，發(fā)現(xiàn)與先天免疫應(yīng)答、吞噬和代謝等相關(guān)基因的DNA甲基化和表達(dá)存在***的差異,，并通過高通量BSP測序?qū)GFL7,、LBP8、PTPRE差異甲基化基因進行了驗證,。 強化版RRBS技術(shù)及應(yīng)用是高性價比方案,。北京TBS技術(shù)服務(wù)方案

    Agilent甲基化芯片通過SurePrint芯片合成**技術(shù)，結(jié)合優(yōu)化的探針設(shè)計及實驗方法,，可靈活進行甲基化研究,，得到高靈敏度、高特異性,、高重復(fù)性的結(jié)果,。技術(shù)流程：1.將基因組DNA超聲打斷成400-500bpDN**段；2.加熱變性并將變性后的單鏈DNA樣品分成兩份,；3.其中一份單鏈DNA樣品加入抗5'-甲基化胞嘧啶核苷抗體,。使用免疫磁珠法分離樣品中甲基化DN**段的抗體復(fù)合物，樣品中其余的非甲基化DN**段被洗脫,；4.純化免疫共沉淀的DN**段,；對MeDIP(Cy5)與Input(Cy3)樣品分別進行標(biāo)記；5.標(biāo)記后的MeDIP與Input樣品混合,、變性,，與芯片雜交；6.檢測雜交信號并進行數(shù)據(jù)分析,。芯片種類：Agilent**甲基化芯片,，8x60K●和合作伙伴在Agilent公司定制的Promoter芯片?！窠^大多數(shù)基因是針對基因啟動子區(qū)域的CpG島設(shè)計探針,。●芯片上一共有4160個功能注釋比較明確的基因,，其中2128個和**發(fā)生有關(guān)系,。●從功能上分,，有256基因和細(xì)胞凋亡有關(guān),，1273個基因和信號傳導(dǎo)有關(guān),，487個基因和壓力和衰老有關(guān)?！裉貏e適用于**甲基化研究,。 遼寧技術(shù)服務(wù)ATAC-seq實驗過程短，從實驗到分析可達(dá)2周,。

    重亞硫酸鹽處理結(jié)合測序是目前檢測甲基化的金標(biāo)準(zhǔn),。除了全基因組甲基化測序技術(shù)等研究手段，對于大樣本量甲基化研究來說,，更需要靈活,、有針對性的技術(shù)方案,。NGS-BSP方法適合幾個到幾十個基因或者位點進行大樣本甲基化測序或者驗證項目,，具有更快速的實驗周期及低成本優(yōu)勢。技術(shù)優(yōu)勢高效靈活的目標(biāo)區(qū)域甲基化檢測的工具BSP和高通量測序完美結(jié)合,，單堿基分辨率適合幾個到幾十個位點的大樣本驗證項目適合所有動物樣本,、周期快、檢測位點靈活,、性價比高科學(xué)方案設(shè)計從項目背景了解,、協(xié)助方案設(shè)計、實驗材料選取,、建庫測序,，到數(shù)據(jù)分析每個項目有特定的科學(xué)問題；需要專業(yè),、有價值的建議,；科學(xué)、縝密的設(shè)計及時高效的溝通,；以保障高質(zhì)量研究成果樣本要求：基因組DNA:>=1ug(20個區(qū)域/位點),；樣品濃度>30ng/ul；無RNA和蛋白污染建庫測序：測序策略：IlluminaHiSeq,PE150,；測序深度：>,。

    Agilent平臺因為MeDIP技術(shù)本身的特點，都不能到達(dá)單堿基的分辨率,，而Illumina的Infinium和GoldenGate檢測技術(shù)卻做得到,。Illumina的Infinium甲基化檢測技術(shù)來源與前期的SNP檢測，采用的是單堿基延伸的原理,。分析利用兩個位點特異的探針檢測這些序列差異的位點,，一個探針是為甲基化位點(M磁珠類型)設(shè)計的，而另一個是為未甲基化位點(U磁珠類型)設(shè)計的,。探針的單堿基延伸摻入了一個標(biāo)記的ddNTP,，它隨后被熒光試劑染色,。通過計算甲基化與未甲基化位點的熒光信號比例，可確定檢測位點的甲基化水平,。Illumina公司早期推出的InfiniumHumanMethylation27BeadChip芯片覆蓋27,578個CpG位點,。這款芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有***的應(yīng)用，除了和**相關(guān)的甲基化篩選之外,，也能用于其他疾病相關(guān)甲基化檢測,。因此對這款產(chǎn)品，研究者給予了很高的評價,，目前此產(chǎn)品已停產(chǎn),，取而代之的是InfiniumHumanMethylation450BeadChip芯片。它以單堿基分辨率覆蓋了基因組中超過45萬個甲基化位點,，實現(xiàn)了基因區(qū)域和CpG島的***覆蓋,。此外，還包括CpG島之外的CpG位點,，在人類干細(xì)胞中鑒定出的非CpG甲基化位點,，以及**和正常組織中差異表達(dá)的甲基化位點等等。它的高覆蓋度,、高通量以及低價格,。 DNA異常甲基化與疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系,。

技術(shù)優(yōu)勢

1,、ChIP-Seq 能實現(xiàn)真正的全基因組分析。目前所能獲得的芯片上固定的探針只能**全基因組部分序列,，所獲得的雜交信息具有偏向性,。

2、對于結(jié)合位點分析,，ChIP-Seq 通過尋找“峰”,，結(jié)合分辨率可精確到10~30 bp，而芯片上探針由于長度所限,，無法精確定位,，即使目前比較高水平的商業(yè)芯片都無法提供可與ChIP-Seq 媲美的分辨率。

3,、是所需樣本數(shù)量,。ChIP-chip 需要多達(dá)4~5 μg?的起始樣本，在雜交之前需要進行LM-PCR,，但可能導(dǎo)致背景增高,，競爭性擴增等導(dǎo)致假陽性。而ChIP-Seq *需要納克級起始材料,，如SOLiD 起始材料可低至20ng,。 ChIP-Seq 能實現(xiàn)真正的全基因組分析,。北京TBS技術(shù)服務(wù)方案

5hmc是發(fā)現(xiàn)的一種修飾堿基，成為哺乳動物的“第六堿基”,。北京TBS技術(shù)服務(wù)方案

    **預(yù)防和***的一個手段是通過去甲基化恢復(fù)某些關(guān)鍵的抑*基因或DNA修復(fù)基因的活性,，目前研究**多的是DNMTs***劑，它通過***DNMT活性以逆轉(zhuǎn)異常的DNA甲基化,。**個表型修飾藥物為5-azacytidine及其類似物5-aza-2'-deoxycytidine（5-aza-CdR）,，這類藥物已經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于白血病前骨髓增生異常綜合征的***。5-aza-CdR是胞嘧啶的類似物,，在DNA復(fù)制過程中可以摻入到DNA鏈中,，一方面它可以降低DNA接收甲基的能力，另一方面它***DNMT活性,，導(dǎo)致DNA甲基化水平的降低,。體外和體內(nèi)試驗均表明，5-aza-CdR具有降低超甲基化的抑*基因甲基化水平從而*****的能力,，臨床表明應(yīng)用5-aza-CdR可提高部分IV期小細(xì)胞肺*患者生存率,，但該藥也存在著不可忽視的毒副作用（如特異性不強，不能針對某一特定抑*基因進行靶向***,；高劑量的5-aza-CdR可能誘發(fā)**的轉(zhuǎn)移），因此其在臨床上的應(yīng)用受到了很大限制,。也有研究表明,，低劑量的As2O3可起到***肝*的目的。 北京TBS技術(shù)服務(wù)方案