PCR擴增效率的高低直接影響**終信號的判讀和實驗結果分析,。在進行熱循環(huán)實驗時，需檢查樣品的密封性以及PCR反應板是否和PCR儀熱蓋完全接觸,，確保PCR過程中樣品反應液沒有蒸發(fā),。QIAcuity數字PCR系統采用**的微反應腔室封閉方式，固態(tài)的物理分割和封閉可有效避免PCR過程中微反應體系的水分蒸發(fā),，確保微反應體系中樣本反應液濃度的恒定,，更易實現準確和精確的定量。原始數據中往往發(fā)現陽性信號與陰性背景之間存在許多弱陽性信號,。因此需要對引物探針進行重新設計和優(yōu)化（詳見引物探針優(yōu)化設計）或提升退火溫度（探針通常比引物高5~10℃）,，以消除疑似熒光信號的“雨區(qū)“現象；此外,，陽性信號和陰性背景間隙過小,，導致**終結果無法準確判讀。因此需要調整引物探針濃度（建議總反應體系引物濃度為600~800nM,；探針濃度為200-400nM）或5' 端**個堿基如有G出現,，則將其互補序列設計為實驗所用探針，以提高陰陽性信號間隙,，便于分析結果的準確判讀,。近年來，Bio-Rad,、凱杰,、賽默飛等巨頭公司紛紛通過收購、投資等方式布局數字PCR業(yè)務,。云南高精確度數字PCR活動

近幾年來,，隨著納米制造技術和微流體技術（nanofabrication and microfluidics）的發(fā)展，數字PCR技術遇到了突破技術瓶頸的比較好契機,。1997年Kalinina, ,、Brown J, 和Silver J使用納升級芯片進行單克隆模板PCR擴增，獲得了美國專利,，更重要的是這種采用“電浸潤法”進行納升級芯片制造技術顯露雛形,。伴隨二代測序技術發(fā)展起來的“油包水PCR”技術，可以一次生成數萬乃至數百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴,，可以作為dPCR的樣品分散載體,。天津PCR數字PCR活動整個實驗流程可在2小時內完成,。

聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，PCR)提出至今已有20年時間,，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學領域的一項關鍵技術和常規(guī)技術,，極大地推動了生命科學各個領域的發(fā)展。特別是90年代后期,，美國ABI公司推出的實時熒光定量PCR(realtimePCR,，qPCR)技術及相關產品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測技術發(fā)展成為一種高靈敏、高特異性和精確定量的基因分析技術,。盡管經過十幾年時間的迅速發(fā)展,，qPCR 技術已經用于除外傷和營養(yǎng)缺乏癥外所有疾病的診斷，但是,，在 PCR擴增過程中影響其擴增效率的因素有很多,，不能保證在反應過程中擴增效率保持不變和實際樣品與標準樣品以及不同樣品之間的擴增效率是相同的，由此導致其定量分析所依賴的基礎——循環(huán)閾值(CT)不是恒定不變的,。因此 qPCR 的定量只是“相對定量”，其準確度和重現性依然不能夠滿足分子生物學定量分析的要求,。

單細胞的基因表達分析：基因表達分析有助于了解細胞和組織的特征及其如何應對發(fā)育和環(huán)境信號的改變,。檢測已知和未知基因轉錄水平的方法在過去的四十多年來發(fā)生了翻天覆地的變化，變得更加有效,，更加敏感,，定量更加精細，能夠一次性對大量的基因轉錄本進行分析,。但是,，在組成復雜的細胞混合物中，盡管***表達的基因可以被識別出來,，但來自于少數細胞群體（例如干細胞）的轉錄本卻很可能會被掩蓋掉,，尤其是在每個細胞中以低豐度形式出現的轉錄本。為了解決這個問題,，單細胞檢測技術應用而生,，而且逐漸受到了越來越多的重視。ddPCR在單細胞分析中的優(yōu)勢在于它不需要標準曲線就能進行***定量,。而且,，由于能夠以非常高的敏感性區(qū)分至少五種不同的基因轉錄本，因此無需進行其他方法所要求的單細胞cDNA預擴增,，這可以消除預擴增和NGS文庫準備中潛在的轉錄本定量失真,，能夠能加真實的反映單細胞群體中關鍵基因的特征。需要對反應體系進行拆分和分配,。

***代PCR技術是常規(guī)PCR技術,，對目的基因擴增后進行凝膠電泳,，將擴增條帶與已知濃度的標準品比較，得到定性結果,，但在產物分析時需要開蓋操作,，容易引起交叉污染，導致假陽性,。第二代PCR技術是在PCR反應體系加入熒光基團,，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR反應進程，通過相關數據分析方法對目的基因進行定量分析的技術,。數字PCR是第三代PCR技術,，是一種采用微流控或微滴化的方法將稀釋后的待測樣品核酸溶液分散至微反應器或微滴中再在相同條件下進行單分子PCR，檢測每一個微反應器或微滴中熒光信號通過直接計數或泊松分布修正得到原始濃度或含量的核酸分子***定量技術,。目前大致可分為三類：微反應室/孔板數字PCR,、大規(guī)模集成微流控芯片數字PCR、液滴數字PCR,。高精確度,、高靈敏度，熒光定量qPCR靈敏度為1%-0.1%,，數字化PCR靈敏度可達0.01-0.001%,。天津PCR數字PCR活動

市場想象空間大，國內外入局者眾多,。云南高精確度數字PCR活動

（5）在SARS-CoV-2核酸參考品制備中,，數字PCR能夠對核酸進行精確的定量，能夠提高世界各國SARS-CoV-2核酸測量結果的一致性和準確性,。（6）數字PCR能夠靈敏檢測與定量環(huán)境中的病毒RNA濃度,，包括從不同環(huán)境中取樣的樣本（如公共區(qū)域、病房,、醫(yī)院衛(wèi)生間,、實驗室操作員手套、廢水等等）,。（7）在實驗室樣品與臨床樣品病毒突變檢測中,，數字PCR適合用于已知的SARS-CoV-2遺傳變異檢測，特別是對于一些低頻突變,。（8）在抗病毒藥物的研發(fā)過程中,，病毒載量的變化是評估藥物有效性的重要指標，借由數字PCR提供的***定量結果,，能夠給出更具說服力和準確的評價結果,。云南高精確度數字PCR活動