微流控芯片技術(shù)的發(fā)展為我們提供了一個實現(xiàn)低成本、小體積和高通量平行PCR分析的理想平臺,。2000年,，Unger等采用多層軟刻蝕 ( multilayer soft lithography，MSL) 技術(shù)在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane,，PDMS) 微流控芯片上設(shè)計并加工高密度微泵微閥結(jié)構(gòu)(如圖2b所示) ，他們將這種芯片稱為IFC( integrated fluidic circuit),。IFC 利用PDMS材料具有高彈性的特點,，通過多層軟刻蝕技術(shù)在芯片上加工交織的液體和氣體通道結(jié)構(gòu)，可以快速并準確地將流體分成若干個**的單元,，進行多步平行反應(yīng),。2006 年Ottesen等將IFC芯片用于數(shù)字PCR分析，通過精細控制微泵微閥的開啟和關(guān)閉，一步操作即可將一個樣本平均分配到 1176個反應(yīng)單元中,，每個反應(yīng)單元的體積只有6. 25 nl,，成功代替了傳統(tǒng)點樣儀和384孔板。他們同時進行了6個樣本7 056個單元的平行數(shù)字PCR分析,。此外,， Hansen及其同事采用 MSL技術(shù)加工了具有10^6個結(jié)構(gòu)單元的數(shù)字PCR 芯片，每個反應(yīng)單元的體積降低至10 pl,，芯片密度達到 440000 /cm2,。與微反應(yīng)室數(shù)字PCR系統(tǒng)相比，IFC的特點是通量更高,，每個反應(yīng)單元的體積更小,，加樣更快。**近,，Men等在2mm×2mm區(qū)域內(nèi)加工了82000個 fl 級反應(yīng)單元,，進行數(shù)字PCR分析。DNA聚合酶對實驗的準確性起著至關(guān)重要的作用,。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR共同合作
ddPCR主要有Bio-rad公司開發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng),，QX200可以將體系分割成2萬個微滴，Rain Drop可以分割成100萬-1 000萬個微滴,。ddPCR原理是通過將一個待分析的PCR反應(yīng)體系進行微滴化處理,，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個油包水小微滴從而對原始體系進行分割，樣品中的核酸分子隨機分配到大量**的微滴中,，每個微滴中含有一個或不含待檢核酸分子,。對微滴體系進行擴增反應(yīng)以后，分析每個微滴的熒光信號,，進行有或無的判斷,，將判斷結(jié)果按照泊松分布的原理，通過讀取靶標和內(nèi)參核酸的陽性微滴個數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度,。與芯片式dPCR相比,，操作簡單，可以實現(xiàn)高通量的檢測,，也保證一定程度上的微滴檢測穩(wěn)定性,。湖北準確數(shù)字PCR活動良好的引物探針設(shè)計是數(shù)字PCR實驗獲得成功的關(guān)鍵因素之一。
20 世紀末,，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR,，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份,，分配到不同的反應(yīng)單元,，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ,，在每個反應(yīng)單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析,。與 qPCR 不同的是,，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴增效率影響,，擴增結(jié)束后通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算每個反應(yīng)單元的平均濃度(含量),，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對照標準樣品和標準曲線來實現(xiàn)***定量分析,。
聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction,，PCR)提出至今已有20年時間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項關(guān)鍵技術(shù)和常規(guī)技術(shù),，極大地推動了生命科學(xué)各個領(lǐng)域的發(fā)展,。特別是90年代后期，美國ABI公司推出的實時熒光定量PCR(realtimePCR,，qPCR)技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測技術(shù)發(fā)展成為一種高靈敏,、高特異性和精確定量的基因分析技術(shù)。盡管經(jīng)過十幾年時間的迅速發(fā)展,，qPCR 技術(shù)已經(jīng)用于除外傷和營養(yǎng)缺乏癥外所有疾病的診斷,，但是，在 PCR擴增過程中影響其擴增效率的因素有很多,，不能保證在反應(yīng)過程中擴增效率保持不變和實際樣品與標準樣品以及不同樣品之間的擴增效率是相同的,，由此導(dǎo)致其定量分析所依賴的基礎(chǔ)——循環(huán)閾值(CT)不是恒定不變的。因此 qPCR 的定量只是“相對定量”,，其準確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學(xué)定量分析的要求,。整個實驗過程需嚴格按照標準流程進行實驗操作。
與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比,，數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度,、特異性和精確性，但截止目前而言,，數(shù)字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法,，我們在看待數(shù)字PCR的應(yīng)用前景時，更應(yīng)該保持一種開放的心態(tài),，與其說數(shù)字PCR技術(shù)是一個新的檢測平臺,，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個平臺上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次,。數(shù)字PCR被稱為第三代PCR技術(shù),，相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，其具有諸多優(yōu)勢：（1）***定量,，不依賴標準品和參考曲線,，定量結(jié)果更加準確可靠；（2）高靈敏度,，可實現(xiàn)單分子級檢測,；（3）高分辨率，適合在大量背景模板的干擾下對罕見的目標分子進行檢測,；（4）高穩(wěn)定性,，對抑制劑的耐受程度**增強。憑借這些優(yōu)勢,，數(shù)字PCR被廣泛應(yīng)用于多個不同的領(lǐng)域[4],，特別是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括稀有突變檢測,、基因拷貝數(shù)變異檢測,、基因表達研究、甲基化水平檢測,、**液體活檢,、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測、微生物（病毒,、細菌等）檢測,、移植排斥監(jiān)控和二代測序輔助建庫等。此外,，此技術(shù)也被用于農(nóng)業(yè),、食品安全和環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域。市場想象空間大,，國內(nèi)外入局者眾多,。重現(xiàn)性數(shù)字PCR歡迎咨詢
基因豐度非常低的，或者樣本濃度低的,，可以選擇數(shù)字化PCR,。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR共同合作
（5）在SARS-CoV-2核酸參考品制備中，數(shù)字PCR能夠?qū)怂徇M行精確的定量,，能夠提高世界各國SARS-CoV-2核酸測量結(jié)果的一致性和準確性,。（6）數(shù)字PCR能夠靈敏檢測與定量環(huán)境中的病毒RNA濃度，包括從不同環(huán)境中取樣的樣本（如公共區(qū)域,、病房,、醫(yī)院衛(wèi)生間、實驗室操作員手套,、廢水等等）,。（7）在實驗室樣品與臨床樣品病毒突變檢測中，數(shù)字PCR適合用于已知的SARS-CoV-2遺傳變異檢測,，特別是對于一些低頻突變,。（8）在抗病毒藥物的研發(fā)過程中,，病毒載量的變化是評估藥物有效性的重要指標，借由數(shù)字PCR提供的***定量結(jié)果,，能夠給出更具說服力和準確的評價結(jié)果,。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR共同合作