WGBS送樣要求一、送樣類型基因組DNA,、細(xì)胞,、全血、動植物組織,、FFPE二,、保存方式1、基因組DNA,、細(xì)胞,、全血、動植物組織：放-20℃冰箱中保存,，或者放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi)),；保存期間避免反復(fù)凍融,。2、FFPE樣本：室溫保存三,、運(yùn)輸條件1,、基因組DNA：冰袋或者干冰運(yùn)輸；2,、細(xì)胞,、全血、組織樣本：干冰運(yùn)輸,，順豐陸運(yùn)（3-4天時間）,，夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰,；3,、FFPE樣本：室溫運(yùn)輸。四,、樣本量要求1,、基因組DNA：常規(guī)WGBS，不少于2ug,；微量WGBS,，20ng1）提供樣本DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果，例如瓊脂糖凝膠電泳或者Agilent2100電泳等,；2）提取基因組DNA,，要加RNA酶，去除RNA污染,；3）提取基因組DNA，溶到TE或者elutionbuffer,避免溶解到純水,；樣本體積不超過100ul;4）提供Qubit檢測濃度,，基于OD值的檢測方法，例如NanoDrop,會嚴(yán)重高估濃度,。2,、細(xì)胞樣本：常規(guī)WGBS，不少于5x10*6個細(xì)胞,；微量WGBS,，5000個細(xì)胞1）收集貼壁或者懸浮細(xì)胞、使用預(yù)冷的1×PBS,，洗滌2次,，600g離心5分鐘；2）***一次離心后,，盡量去除上清PBS,，保留細(xì)胞沉淀;3,、全血樣本：2-5ml外周血使用普通EDTA抗凝管，避免使用肝素抗凝管,。4,、動植物組織：動物組織，30mg以上;植物組織,，不同組織,。 在哺乳動物中CpG以兩種形式存在。上海ATAC技術(shù)服務(wù)方案

    Agilent甲基化芯片通過SurePrint芯片合成**技術(shù),，結(jié)合優(yōu)化的探針設(shè)計及實驗方法,，可靈活進(jìn)行甲基化研究，得到高靈敏度,、高特異性,、高重復(fù)性的結(jié)果。技術(shù)流程：1.將基因組DNA超聲打斷成400-500bpDN**段,；2.加熱變性并將變性后的單鏈DNA樣品分成兩份,；3.其中一份單鏈DNA樣品加入抗5'-甲基化胞嘧啶核苷抗體。使用免疫磁珠法分離樣品中甲基化DN**段的抗體復(fù)合物,，樣品中其余的非甲基化DN**段被洗脫,；4.純化免疫共沉淀的DN**段；對MeDIP(Cy5)與Input(Cy3)樣品分別進(jìn)行標(biāo)記,；5.標(biāo)記后的MeDIP與Input樣品混合,、變性，與芯片雜交,；6.檢測雜交信號并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,。芯片種類：Agilent**甲基化芯片，8x60K●和合作伙伴在Agilent公司定制的Promoter芯片,?！窠^大多數(shù)基因是針對基因啟動子區(qū)域的CpG島設(shè)計探針?！裥酒弦还灿?160個功能注釋比較明確的基因,，其中2128個和**發(fā)生有關(guān)系?！駨墓δ苌戏?，有256基因和細(xì)胞凋亡有關(guān)，1273個基因和信號傳導(dǎo)有關(guān),，487個基因和壓力和衰老有關(guān),。●特別適用于**甲基化研究。 上海ATAC技術(shù)服務(wù)方案FFPE樣本只需要室溫運(yùn)輸,。

發(fā)育基因的表觀突變是養(yǎng)殖歐洲鱸魚開始馴化的基礎(chǔ)

Epimutations in developmental

genes underlie the onset of domestication in farmed European sea bass. Mol Biol Evol. 2019 May 30 (IF= 14.797)

本研究通過RRBS測序,，比較了早期馴化的

(n=12)與野生的(n=12)

歐洲鱸魚在馴化過程中DNA甲基化變化，發(fā)現(xiàn)早期馴化的鱸魚與野生的沒有遺傳差異,，但在不同胚胎起源的組織中發(fā)生DNA甲基化變化,。這些甲基化突變與經(jīng)過25年選擇性育種后的胞嘧啶至胸腺嘧啶多態(tài)性***重疊，表觀突變基因與正選擇基因一致,。結(jié)果表明馴化初始階的表觀變異是一個重要事件,。

    全基因組甲基化測序(WholeGenomeBisulfiteSequencing,WGBS)是結(jié)合重亞硫酸鹽Bisulfite處理和高通量測序，對有參考基因組進(jìn)行全基因組的單堿基分辨率的甲基化檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”方案,，***用于人,、哺乳動物及農(nóng)林牧漁方向的高水平甲基化研究。WGBS滿足全基因組DNA甲基化圖譜及疾病關(guān)聯(lián)分析,、基因調(diào)控分析,、疾病的甲基化標(biāo)志物篩選等探索性課題的研究。靈長類早期著床前胚胎發(fā)育中的DNA甲基化重編程研究——(團(tuán)隊成員發(fā)表).(IF=)靈長類胚胎發(fā)生的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控需要DNA甲基化重編程,。我們首先建立了基于轉(zhuǎn)座酶的超微量WGBS測序技術(shù),，詳細(xì)研究了獼猴早期著床前胚胎7個階段(Sperm、Oocytes,、Zygotes,、2-cell、8-cell,、Morula和ICM)的DNA甲基化動態(tài)變化過程,。******闡明了DNA甲基化動力學(xué)的“盈與虧”階段特征，并通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺失實驗表明DNA甲基化影響早期猴胚胎發(fā)育,。 中小樣本篩選, 大樣本中進(jìn)一步驗證,。

    **預(yù)防和***的一個手段是通過去甲基化恢復(fù)某些關(guān)鍵的抑*基因或DNA修復(fù)基因的活性，目前研究**多的是DNMTs***劑,，它通過***DNMT活性以逆轉(zhuǎn)異常的DNA甲基化,。**個表型修飾藥物為5-azacytidine及其類似物5-aza-2'-deoxycytidine（5-aza-CdR），這類藥物已經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于白血病前骨髓增生異常綜合征的***,。5-aza-CdR是胞嘧啶的類似物，在DNA復(fù)制過程中可以摻入到DNA鏈中,，一方面它可以降低DNA接收甲基的能力,，另一方面它***DNMT活性，導(dǎo)致DNA甲基化水平的降低,。體外和體內(nèi)試驗均表明,，5-aza-CdR具有降低超甲基化的抑*基因甲基化水平從而*****的能力，臨床表明應(yīng)用5-aza-CdR可提高部分IV期小細(xì)胞肺*患者生存率，但該藥也存在著不可忽視的毒副作用（如特異性不強(qiáng),，不能針對某一特定抑*基因進(jìn)行靶向***,；高劑量的5-aza-CdR可能誘發(fā)**的轉(zhuǎn)移），因此其在臨床上的應(yīng)用受到了很大限制,。也有研究表明,，低劑量的As2O3可起到***肝*的目的。 RRBS用于人,、哺乳動物及魚類方向的高水平甲基化研究,。上海ATAC技術(shù)服務(wù)方案

RRBS開發(fā)的初衷就是為人和哺乳動物，提供全基因組范圍的,、高性價比的甲基化檢測金標(biāo)準(zhǔn)方案,。上海ATAC技術(shù)服務(wù)方案

    羥甲基化DNA免疫沉淀測序（HydroxymethylatedDNAImmunoprecipitationSequencing，hMeDIP-Seq）是通過5hmC特異性抗體富集羥甲基化的DN**段,，然后結(jié)合高通量測序技術(shù)在全基因組水平上以較小的數(shù)據(jù)量,，快速、高效地尋找羥甲基化區(qū)域,?？蓮V泛應(yīng)用于羥甲基化與疾病關(guān)系研究以及羥甲基化在胚胎發(fā)育過程中的研究。技術(shù)優(yōu)勢從項目背景了解,、協(xié)助方案設(shè)計,、實驗材料選取、建庫測序,，到數(shù)據(jù)分析每個項目有特定的科學(xué)問題,；需要專業(yè)、有價值的建議,；科學(xué),、縝密的設(shè)計及時高效的溝通；以保障高質(zhì)量研究成果樣本要求：基因組DNA:>=3ug,；樣品濃度>50ng/ul,；無RNA和蛋白污染建庫測序：測序策略：IlluminaHiSeq,PE150;測序深度：20-30Mreads信息分析基于全基因組范圍的羥甲基化分析，數(shù)據(jù)質(zhì)控,，Peak鋒Calling,，Peak鋒在基因組、染色體,、功能元件上的分布,，多樣本羥甲基化差異聚類，差異羥甲基化DMR鑒定及相關(guān)基因的功能分析,，結(jié)合項目背景和科學(xué)問題的數(shù)據(jù)亮點(diǎn)挖掘,。 上海ATAC技術(shù)服務(wù)方案