在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞凍存是**關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,，尤其在細(xì)胞***,、細(xì)胞存儲(chǔ)中對(duì)細(xì)胞凍存更有特殊要求，下面就根據(jù)降溫速度以及凍存液組分對(duì)細(xì)胞凍存做詳細(xì)介紹,。根據(jù)降溫速度區(qū)分,，細(xì)胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存。根據(jù)凍存方式不同可以分為慢速凍存（程序降溫法）與快速凍存（非程序降溫法）,。程序降溫凍存技術(shù)要點(diǎn)是慢凍,，標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2/℃min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí),，可增至-5℃～-10℃/min,。之前，常用的傳統(tǒng)方法是將凍存管置于4℃30分鐘--->-20℃60分鐘--->-80℃過夜--->液氮罐,。不過,，由于步驟較多，間隔時(shí)間又長,，很容易遺忘,。之后，人們也開始使用程序降溫盒,。將凍存管放入程序降溫盒中,，再將程序降溫盒放入-80℃冰箱。以1℃/min的速度進(jìn)行降溫,?？焖賰龃婕床恍枰?jīng)過梯度降溫，直接將細(xì)胞放入-80℃冰箱24h,，后轉(zhuǎn)入液氮長期凍存,。快速凍存簡化了凍存步驟,，同時(shí)不需要使用梯度凍存盒,。不同的凍存方法**了不同的凍存體系，程序降溫法使用的凍存液主要配方為培養(yǎng)基,、血清,、DMSO。血清大多采用牛源，同時(shí)血清中未知成分和病毒等***物質(zhì)會(huì)給凍存帶來影響與風(fēng)險(xiǎn),，該方法科研上***使用,，并延續(xù)至今。無血清細(xì)胞凍存液說明書,。宿遷懸浮細(xì)胞凍存液可以放多久

    使細(xì)胞凍結(jié)中冰晶形成減少,，從而避免了由于冰晶形成對(duì)細(xì)胞中生命活性物質(zhì)的一系列損傷?！?】細(xì)胞凍存時(shí)利用低溫降低細(xì)胞代謝,，使細(xì)胞處于停止生長的“休眠”狀態(tài)，等需要使用的時(shí)候再進(jìn)行復(fù)蘇操作,。細(xì)胞儲(chǔ)存在-70℃冰箱中,，可以保存一年；若儲(chǔ)存在-196℃的液氮環(huán)境中,，理論上可以實(shí)現(xiàn)長期永存,。02細(xì)胞凍存的常見方法細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的關(guān)鍵要點(diǎn)是慢凍快融。細(xì)胞凍存的效果主要與降溫步驟,、凍存保護(hù)液的使用,、凍存溫度、復(fù)溫速率及用于凍存的細(xì)胞生長狀態(tài)有關(guān),?！?】降溫速率過快容易引起細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷，所以為防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰必須采用一個(gè)“慢”的降溫過程,，并使用凍存保護(hù)劑,，即凍存液。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作保護(hù)劑,。根據(jù)降溫速度區(qū)分,，細(xì)胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存。傳統(tǒng)的凍存方法是將冷凍管置于4℃30分鐘,、-20℃30分鐘,、-80℃過夜再轉(zhuǎn)液氮。這種凍存方法步驟多,，而且需要遵守幾個(gè)時(shí)間點(diǎn),，容易被遺忘，對(duì)于繁忙的實(shí)驗(yàn)人員而言不那么友好,。而程序降溫方法,，采用降溫速率-1℃～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí),，可增至-5℃～-10℃/min,，再放至-196℃液氮保存,。常規(guī)的程序降溫凍存方法較為復(fù)雜、費(fèi)時(shí),，需要儀器設(shè)備花費(fèi)較高,。細(xì)胞凍存有用嗎無血清細(xì)胞凍存液使用的是什么技術(shù),？

    有些則不需要,。降溫盒須恢復(fù)室溫后再使用。根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn),，使用程序凍存盒凍存效果良好,，沒有凍存盒的同學(xué)可以參照下文方法二和方法三。操作步驟步驟1：配制程序凍存液,，放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心,，懸浮細(xì)胞直接離心，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,，時(shí)間3min）步驟3：用配制好的凍存液重懸細(xì)胞,，按照1~，擰緊管蓋,，做好標(biāo)記步驟4：凍存管放入凍存盒,，凍存盒放入-80℃冰箱過夜（24h）步驟5：凍存管從凍存盒取出，轉(zhuǎn)移至液氮長期保存方法二：使用無血清非程序凍存液無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液,，無需自己配制,，無需降溫盒，**提升了便捷性,。但是,，并非所有細(xì)胞都適用于這種凍存液，使用前必須做凍存測試,，沒問題后再批量應(yīng)用,。操作步驟步驟1：從冰箱拿出無血清非程序凍存液，待用步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心,，懸浮細(xì)胞直接離心,，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時(shí)間3min）步驟3：棄上清,，加入適量無血清非程序凍存液,，重懸細(xì)胞步驟4：按照1~，擰緊管蓋,，做好標(biāo)記步驟5：將凍存管直接移入-80℃冰箱中,。

    嚴(yán)禁充裝液氧等易燃易爆及腐蝕性液體，以免產(chǎn)生猛烈燃燒,、或?qū)θ萜鳟a(chǎn)生腐蝕,。液氮是**溫液體（-196℃），在充裝時(shí)，要穿長袖工作服,、帶皮手套,，以避免液氮飛濺造成***。貯存容器不得作貯運(yùn)容器使用,。若運(yùn)輸液氮,。必須使用B型貯運(yùn)容器。因此類容器有特殊支撐結(jié)構(gòu),堅(jiān)固可靠不易損壞,。4．液氮容器在使用過程中,，每天都應(yīng)隨時(shí)檢查容器的使用情況，如發(fā)現(xiàn)容器瓶蓋上和上部有水珠或結(jié)霜情況,，說明容器質(zhì)量出現(xiàn)問題,，應(yīng)立即停止使用。5．存入取出樣品要標(biāo)記,，拿取東西要輕拿輕放,。一、細(xì)胞凍存方法：凍存液**好現(xiàn)配：按1：3：6（或1：2：7）配凍存液1份DMSO3份血清和6份培養(yǎng)基(養(yǎng)細(xì)胞時(shí)用什么培養(yǎng)基凍存時(shí)就用什么培養(yǎng)基),。取生長狀態(tài)量好的細(xì)胞進(jìn)行凍存處理,，對(duì)于貼壁細(xì)胞：1吸出舊培養(yǎng)液加PBS沖洗一次2胰酶消化3加培養(yǎng)基中止消化，有的細(xì)胞是加血清中止4離心收集細(xì)胞,，不同細(xì)胞離心率不一樣（以上*為貼壁細(xì)胞,，懸浮細(xì)胞收集就用第四部）5吸出離心管上清液，加1ML的凍存液重懸細(xì)胞,，移到凍存管,，放4度半小時(shí)，-20度兩小時(shí),，-70度過夜,，再放液氮長期保存懸浮細(xì)胞：直接離心收集，PBS洗滌作者：英格恩鏈接：zhuanlan./p/來源：知乎著作權(quán)歸作者所有,。商業(yè)轉(zhuǎn)載請(qǐng)聯(lián)系作者獲得授權(quán),。南京翌科生物科技有限公司無血清細(xì)胞凍存液比較靠譜。

    傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存液是使用培養(yǎng)基,、血清和DMSO按照一定的比例混合,，其中DMSO的含量10%，血清的含量是10%,，統(tǒng)稱為含血清細(xì)胞凍存液,。含血清細(xì)胞凍存液的一般的凍存方法是梯度降溫凍存法，如先將冷凍管置于4℃冰箱10分鐘,，然后移至-20℃冰箱30分鐘,，再移至-80℃冰箱保存16-18個(gè)小時(shí)（或隔夜）,，**后才移至液氮罐中進(jìn)行長期的儲(chǔ)存。（其中需要注意的是-20℃條件下不可超過1個(gè)小時(shí),，以防止冰晶過大,，造成細(xì)胞大量的死亡。）可見,，含血清細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞時(shí)遇到的問題：1.凍存細(xì)胞時(shí)需現(xiàn)配凍存液(如購買市面上通用的含血清細(xì)胞凍存液,，此步可省略)2.需要程序降溫（4℃→-20℃→-80℃→液氮），步驟繁瑣,，耗時(shí)耗力3.含血清,，細(xì)胞污染(病毒、霉菌和支原體等)的風(fēng)險(xiǎn)更高4.血清批次,、品質(zhì)間差異導(dǎo)致凍存液的批次間差異5.需液氮凍存，且不能原位（如孔板）凍存QuickFreezing-M是一種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán),、獨(dú)特配方的哺乳動(dòng)物細(xì)胞凍存液,，其化學(xué)組成明確，以DMEM為母液,，含有DMSO,，不含牛血清或其他蛋白成分。具有高效,、低毒,、無外源因子和易于使用等優(yōu)點(diǎn)，推薦用于常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存,。QuickFreezing-M無血清細(xì)胞冷凍液的使用方法：1.用37℃水浴解凍細(xì)胞凍存液,。無血清細(xì)胞凍存液的保質(zhì)期是多久？淮安細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞凍存液保質(zhì)期

無血清細(xì)胞凍存液應(yīng)細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)90%以上,。宿遷懸浮細(xì)胞凍存液可以放多久

    進(jìn)行瓶口消毒,，棄去細(xì)胞原來的培養(yǎng)基。按每25cm2/ml胰酶/EDTA消化液比例加入消化液,，放入顯微鏡下觀察,，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺(tái)內(nèi)，加入2ml細(xì)胞完全培養(yǎng)基以立即終止消化,。采用無菌***頭輕輕吹打細(xì)胞表面,，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打,，后上下吹打的方式,，取所有細(xì)胞懸液放入一干凈的15毫升離心管內(nèi)。配平離心：采用天平配平兩端,，每分鐘800轉(zhuǎn),，室溫離心5分鐘,。采用羅氏CASY-DT快速細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。加入10mlCASY-ton至以標(biāo)記viable的管子中,，加入100μl細(xì)胞懸液,，顛倒混勻三次，可進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),?？梢娒亢辽龖乙褐杏谢罴?xì)胞總數(shù)。取出凍存管,，注明細(xì)胞名稱,、代數(shù)、日期,。離心后,，以無菌吸管吸棄上清液，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀,。將細(xì)胞沉淀與凍存液充分混勻,，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞總數(shù)調(diào)節(jié)至細(xì)胞數(shù)量為每毫升有5×10?為宜,。將細(xì)胞凍存懸液分裝入細(xì)胞凍存管中,，一般一個(gè)兩毫升凍存管裝入1至毫升細(xì)胞凍存懸液為宜。嚴(yán)密封口后,，進(jìn)行程序性降溫凍存：首先﹣4℃30分鐘,，20℃30分鐘，﹣80℃過夜,，**后進(jìn)行液氮保存,。另有一種比較實(shí)用的降溫方法：用**少兩厘米厚的醫(yī)用棉紗將凍存管緊緊包裹，扎緊,，直接放入-70℃冰箱,。宿遷懸浮細(xì)胞凍存液可以放多久