聚合酶鏈?zhǔn)剑篜CR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程,，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個(gè)循環(huán)需2-4分鐘,，2-3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,?！CR技術(shù)敏感性高，特異性強(qiáng),，操作簡(jiǎn)便,、快速，在生命科學(xué)研究,、食品衛(wèi)生,、醫(yī)療、法醫(yī)及環(huán)境監(jiān)測(cè)等諸多方面都具有重要的應(yīng)用價(jià)值,。聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長(zhǎng)移液器吸頭的移液器,。莆田骨頭PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DN段，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克,、微克、毫克級(jí)的特異性DN段,。因此,，PCR技術(shù)一經(jīng)問(wèn)世就被迅速而較廣地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域?！‘惓＝Y(jié)果： 各種疾病所致的異常,，例如梅毒。一期梅毒,。即硬下疳 ,，潛伏期2-4周，外生殖器部位發(fā)生暗紅色硬腫塊 ,、淺潰瘍 ,，有軟骨樣硬度，周圍淋巴結(jié)腫大,。二期梅毒,。在一期梅毒 1-2 個(gè)月之后，全身皮膚,、粘膜發(fā)生對(duì)稱泛發(fā)皮疹,、斑疹、,、疹等,。粘膜可發(fā)生粘膜斑、扁平濕疣,，傳染性強(qiáng),。三期梅毒。發(fā)生在染上后2-3年乃至10年,，皮膚為樹(shù)膠樣腫,，還可涉及骨、關(guān)節(jié),、心,、血管，表現(xiàn)為主動(dòng)脈炎,、主動(dòng)脈瓣閉鎖不全和主動(dòng)脈瘤等,，侵及神經(jīng)為脊髓癆 ，全身麻痹 ( 麻痹性癡呆 )等等?！⌒枰獧z查的人群：疑似某種特定的疾病病人,，進(jìn)行分子特異性檢查。蘇州細(xì)胞熒光PCR應(yīng)用嵌套式PCR在特異性擴(kuò)增長(zhǎng)DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功,，但它需要更詳細(xì)的目標(biāo)序列知識(shí),。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計(jì)：PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物,。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)）,，5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ),。引物設(shè)計(jì)的基本原則：引物長(zhǎng)度：15-30bp,，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC很好隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合,；堿基配對(duì)原則,；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性,。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵,。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性,，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行,，結(jié)合的特異性增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度,。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),，其特異性程度就更高。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以創(chuàng)造特定的長(zhǎng)DNA構(gòu)建體,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度,。在該步驟中，DNA聚合酶通過(guò)從反應(yīng)混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補(bǔ)的游離DNA鏈來(lái)合成與DNA模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈,，在新生(伸長(zhǎng))DNA鏈的末端,，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合。延伸所需的精確時(shí)間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴(kuò)增的DNA目標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度,。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),，在很好溫度下，大多數(shù)DNA聚合酶每分鐘聚合一千個(gè)堿基。在很好條件下(即,，如果沒(méi)有限制底物或試劑的限制),，在每個(gè)延伸/延伸步驟中，DNA靶序列的數(shù)量加倍,。隨著每一個(gè)連續(xù)的循環(huán),，原始模板鏈加上所有新產(chǎn)生的鏈成為下一輪延伸的模板鏈，導(dǎo)致特定DNA目標(biāo)區(qū)域的指數(shù)(幾何)擴(kuò)增,。如果基因的基因組DNA序列是已知的,，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來(lái)繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置。溫州骨頭Real-time PCR網(wǎng)站

PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加,。莆田骨頭PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈反應(yīng)也可以用作以下敏感試驗(yàn)的一部分組織分型，對(duì)移植至關(guān)重要,。截至2008年,，甚至有人提議用聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)取代傳統(tǒng)的血型抗體檢測(cè)。許多形式的病癥涉及致病基因的改變,。通過(guò)使用基于聚合酶鏈反應(yīng)的測(cè)試來(lái)研究這些突變,，醫(yī)治方案有時(shí)可以根據(jù)患者的不同而不同。聚合酶鏈反應(yīng)可以早期診斷惡性疾病,，如白血病和淋巴瘤,，這是目前病癥研究中發(fā)展很快的，并且已經(jīng)被常規(guī)使用,。PCR檢測(cè)可以直接在基因組DNA樣品上進(jìn)行,，以檢測(cè)易位特異性惡性細(xì)胞，其靈敏度至少是其他方法的10,，000倍,。聚合酶鏈反應(yīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域非常有用，因?yàn)樗试S分離和擴(kuò)增病癥抑制劑,。例如,，定量PCR可以用于量化和分析單細(xì)胞，以及識(shí)別DNA,、mRNA和蛋白質(zhì)的確認(rèn)和組合,。莆田骨頭PCR檢測(cè)技術(shù)網(wǎng)站