聚合酶鏈式反應：三步：變性：模板DNA加熱變性,；復性,，引物與它的靶序列發(fā)生退火，引物DNA量多,，使引物和模板在局部形成雜交鏈,；延伸，4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下，DNA合成酶催化以引物為起始點,，按5'-3'方向進行延伸,。上面三步為一個循環(huán)，可使拷貝數到達2*E－6-2*E－7,。PCR產物一段雙鏈DNA,，是由它的末端引物的5’端決定的。首輪擴增,，其產物是大小不均一的DNA分子,。長度應大于兩引物之間的長度。在第二個循環(huán)中,，由于5'固定,，其產物長度就由等于兩引物之間的長度。所以幾十個循環(huán)后就會產生大量的兩引物之間序列,。為了很大限度地減少污染的可能性,，調查人員應該為試劑制備、聚合酶鏈反應和產品分析預留單獨的房間,。寧波骨頭RT-PCR檢測技術應用

聚合酶鏈式反應PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后,，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈，以便它與引物結合,，為下輪反應作準備,；模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合,；引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下,，以dNTP為反應原料,，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈,，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍?；窗步M織PCR檢測技術多重連接依賴探針擴增允許用單個引物對擴增多個靶標,，從而避免多重PCR的分辨率限制,。

聚合酶鏈反應的一個主要限制是，為了產生允許其選擇性擴增的引物,，需要關于目標序列的先前信息,。這意味著，通常情況下,，PCR用戶必須知道兩個單鏈模板中每個模板上目標區(qū)域上游的精確序列,，以確保DNA聚合酶正確結合引物-模板雜交體，并隨后在DNA合成過程中產生整個目標區(qū)域,。像所有酶一樣,，DNA聚合酶也容易出錯，這反過來會導致產生的PCR片段發(fā)生突變,。PCR的另一個限制是,，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增，導致誤導或模糊的結果,。為了很大限度地減少污染的可能性,，調查人員應該為試劑制備、聚合酶鏈反應和產品分析預留單獨的房間,。試劑應分配到一次性的等分試樣中,。應經常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。

聚合酶鏈式反應的試驗污染：陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照,，它是PCR反應是否成功,、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等,、重復性好,，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照,，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）,。但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大,。因而當某一PCR試劑經自己使用穩(wěn)定,，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照,。陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照,。它包括：標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照,。試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染,。逆轉錄聚合酶鏈反應(逆轉錄-聚合酶鏈反應)：用于從RNA中擴增DNA,。

聚合酶鏈式反應：RNA和DNA的五碳糖,，前者比后者多了一個O，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同,，即O原子造成U和T的不同,，U分子化學式C4H4N2O2，T胸腺嘧啶化學式C5H6N2O2,，現在將兩個分子式進行對比,，U比T多了CH2，結合前面的核糖區(qū)別,，還有一個O分子,，其余結構相同，那么O和CH2之間的聯系是什么?是什么導致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2,？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T,？若從結構上說，直接從U中加入一個CH2,，得到了T,，這里面介入化學鍵的斷裂和重組，但是這樣一來的話,，即使U變成了T,，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個O分子，只是此時結構是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C）,，形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了,。此時將這種分子導入受體細胞（亦或者蛋白質）中，表達的性質一定不同于病毒表達的性質,。聚合酶鏈反應具有定量合成產物的優(yōu)點,。蘇州特殊樣本Real-time PCR服務

聚合酶鏈反應是一種非常強大和實用的研究工具。寧波骨頭RT-PCR檢測技術應用

聚合酶鏈反應注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解,，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂,；為了防止非特異性擴增,，必須設陰性對照；內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量,。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差,、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,；PCR不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度,、序列,、二級結構以及目標DNA起始的數量有關,。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環(huán)數，均應通過單獨實驗來確定,；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA,； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性,。寧波骨頭RT-PCR檢測技術應用