聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi),，有些很好于當(dāng)日電泳檢測,，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。假陰性：不出現(xiàn)擴增條帶,。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備,，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用,， PCR循環(huán)條件,。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì),，模板中含有Taq酶抑制劑,，模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白,，在提取制備模板時丟失過多,，或吸入酚。模板核酸變性不徹底,。在酶和引物質(zhì)量好時,，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理,，模板核酸提取過程出了毛病,，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改,。聚合酶鏈式反應(yīng)中兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列,，尤其是避免3 ′端的互補重疊。珠海分子生物學(xué)數(shù)字PCR服務(wù)

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：無擴增條帶：酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶,。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當(dāng)而失活,，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果,。變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活,；過低則模板變性不徹底,。反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前,，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min,。引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確,。是否純化,，或因儲存條件不當(dāng)而失活。引物錯誤,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物,。 DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題,。珠海分子生物學(xué)數(shù)字PCR服務(wù)聚合酶鏈式反應(yīng)中要確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻,。

聚合酶鏈反應(yīng)：等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng):基于單核苷酸變異的診斷或克隆技術(shù)(snv不要與 SNPs 混淆)(患者的單堿基差異)。它需要事先知道DNA序列,，包括等位基因之間的差異,，并使用3’端包含SNV的引物(通常包含SNV周圍的堿基對緩沖液)。在模板和引物不匹配的情況下,，嚴格條件下的PCR擴增效率要低得多,，因此用單核苷酸多態(tài)性特異性引物成功擴增表明序列中存在特異性單核苷酸多態(tài)性,。有關(guān)更多信息,，請參見單核苷酸多態(tài)性基因分型。裝配聚合酶鏈反應(yīng)或者聚合酶循環(huán)組件:通過對具有短重疊片段的長寡核苷酸池進行PCR來人工合成長DNA序列,。寡核苷酸在有義和反義方向之間交替,，重疊片段決定聚合酶鏈反應(yīng)片段的順序，從而選擇性地產(chǎn)生很終的長DNA產(chǎn)物,。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA,，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,。再以cDNA為模板進行PCR擴增,，而獲得目的基因或檢測基因表達。完整RNA 的提取和純化,，是進行RNA 方面的研究工作,，如Nothern雜交、mRNA 分離,、RT-PCR,、定量PCR,、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關(guān)鍵點,，即樣品細胞或組織的有效破碎,；有效地使白復(fù)合體變性；對內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制,；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離,；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中很關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性,。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑,，提取總核酸，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來,；直接在酸性條件下抽提,，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進入有機相而RNA 留在水相。種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA 的丟失,，目前該方法的使用頻率已很低,。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以創(chuàng)造特定的長DNA構(gòu)建體。

聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合,，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的,。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時其條帶更整齊，亮度更高,。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列,。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物,。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高,，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對策有：減少酶量,，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度,。增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。聚合酶鏈反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物,、酶,、dNTP、模板和緩沖液,。福州分子生物學(xué)Real-time PCR

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,，能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平。珠海分子生物學(xué)數(shù)字PCR服務(wù)

聚合酶鏈式反應(yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù),。工具/原料：擴增緩沖液,，四種dNTP，引物,，模板DNA,，Taq DNA聚合酶， Mg離子,，蒸餾水,。模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備,；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合,；引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈,。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。珠海分子生物學(xué)數(shù)字PCR服務(wù)