聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：MgCl2濃度過高。可適當降低其用量,。模板量過多,。質(zhì)粒DNA的用量應<50 ng,，而基因組DNA則應<200 ng,。引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應,。循環(huán)次數(shù)過多,；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時間及延伸時間,，或改用二種溫度的PCR循環(huán),。退火溫度過低。電泳體系有問題：凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大,；凝膠沒有凝固好,；瓊脂糖質(zhì)量差。若為PCR試劑盒則可能：由于運輸儲存不當引起試劑盒失效,；試劑盒本身質(zhì)量有問題,，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當,。降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布,。PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi)，有些很好于當日電泳檢測,，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失,。蘇州實時數(shù)字PCR原理

聚合酶鏈式：PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結合，為下輪反應作準備,；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合,；引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應原料，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復制原理,，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2-4分鐘，2-3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。　PCR技術敏感性高,，特異性強,，操作簡便、快速,，在生命科學研究,、食品衛(wèi)生、醫(yī)療,、法醫(yī)及環(huán)境監(jiān)測等諸多方面都具有重要的應用價值,。蘇州實時數(shù)字PCR原理聚合酶鏈式反應中要確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。

PCR的反應條件：dNTP濃度過高會加快反應速度,，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率,。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增,，低則合成產(chǎn)物量減少,。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸,，一個30個循環(huán)的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率,。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s,。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多,。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結合。引物長度在15～25時退火溫度,。

聚合酶鏈式反應的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結合,，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的,。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時其條帶更整齊，亮度更高,。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列,。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物,。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高,，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對策有：減少酶量,，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度,。適當降低Mg2+濃 度,。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù),。聚合酶鏈式反應是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術,。

聚合酶鏈反應有許多優(yōu)點。它很容易理解和使用,，并迅速產(chǎn)生結果,。這項技術非常敏感，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝,，用于測序,、克隆和分析。qRT-PCR具有與PCR相同的優(yōu)點,，同時還具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點,。因此，它可以用于分析病癥,、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達水平的變化,。聚合酶鏈反應是一種非常強大和實用的研究工具。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應得到解決。這項技術可以幫助我們識別與已知病毒相關的未知病毒序列,，從而讓我們更好地了解疾病本身,。如果該過程可以進一步簡化，并且可以開發(fā)靈敏的非輻射檢測系統(tǒng),，PCR將在未來幾年在臨床實驗室中占據(jù)明顯地位,。聚合酶鏈式反應的引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。廣州特殊樣本數(shù)字PCR設計公司

流聚合酶鏈反應：一種偽等溫PCR方法,。蘇州實時數(shù)字PCR原理

聚合酶鏈式反應PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈,，以便它與引物結合,，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃,、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下,，以dNTP為反應原料，靶序列為模板,，按堿基互補配對與半保留復制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,。蘇州實時數(shù)字PCR原理