聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,，PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加,。因此，無論是化石中的古生物,、歷史人物的殘骸,，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液,，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA,，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對(duì),。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在,。由1983年美國首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),，即簡易DNA擴(kuò)增法,，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到2013年,，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù),。聚合酶鏈反應(yīng)非常敏感，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝,，用于測(cè)序,、克隆和分析。上海實(shí)時(shí)熒光定量PCR服務(wù)

聚合酶鏈反應(yīng)：等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng):基于單核苷酸變異的診斷或克隆技術(shù)(snv不要與 SNPs 混淆)(患者的單堿基差異),。它需要事先知道DNA序列,，包括等位基因之間的差異，并使用3’端包含SNV的引物(通常包含SNV周圍的堿基對(duì)緩沖液),。在模板和引物不匹配的情況下,，嚴(yán)格條件下的PCR擴(kuò)增效率要低得多,，因此用單核苷酸多態(tài)性特異性引物成功擴(kuò)增表明序列中存在特異性單核苷酸多態(tài)性。有關(guān)更多信息,，請(qǐng)參見單核苷酸多態(tài)性基因分型,。裝配聚合酶鏈反應(yīng)或者聚合酶循環(huán)組件:通過對(duì)具有短重疊片段的長寡核苷酸池進(jìn)行PCR來人工合成長DNA序列。寡核苷酸在有義和反義方向之間交替,，重疊片段決定聚合酶鏈反應(yīng)片段的順序,，從而選擇性地產(chǎn)生很終的長DNA產(chǎn)物。寧波骨頭Real-time PCR原理PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi),，有些很好于當(dāng)日電泳檢測(cè),，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計(jì)：PCR反應(yīng)中有兩條引物,，即5′端引物和3′引物,。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同,；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ),。引物設(shè)計(jì)的基本原則：引物長度：15-30bp，常用為20bp左右,。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC很好隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))：用于從RNA中擴(kuò)增DNA,。

聚合酶鏈反應(yīng)：多重連接依賴探針擴(kuò)增（MLPA):允許用單個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)，從而避免多重PCR的分辨率限制,。多重聚合酶鏈反應(yīng):由單個(gè)PCR混合物中的多個(gè)引物組組成,，以產(chǎn)生對(duì)不同DNA序列特異的不同大小的擴(kuò)增子。通過同時(shí)靶向多個(gè)基因,，可以從單次測(cè)試中獲得額外的信息,，否則將需要幾次試劑和更多時(shí)間來執(zhí)行。每個(gè)引物組的退火溫度必須優(yōu)化,，以在單個(gè)反應(yīng)中正確工作,，并符合擴(kuò)增子尺寸。也就是說,，當(dāng)通過凝膠電泳可視化時(shí),，它們的堿基對(duì)長度應(yīng)該足夠不同以形成不同的條帶。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。蘇州特殊樣本Real-time PCR網(wǎng)站

逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ,，然后通過聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增,。上海實(shí)時(shí)熒光定量PCR服務(wù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：反應(yīng)的控制：PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子；鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高,，常用1.5mmol/L,；底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L,；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）,；引物濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L；反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù),；變性溫度和時(shí)間 95℃,，30s；退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右,，一般在45～55℃,；延伸溫度和時(shí)間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）,；Tm值=4(G+C) +2(A+T),；循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量,。模板初始濃度低,，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的,。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右,，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和,，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。上海實(shí)時(shí)熒光定量PCR服務(wù)