聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補,、或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物,。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量，適當(dāng)增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）,。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)：一種用于將兩個或多個含有互補序列的DN段拼接在一起的基因工程技術(shù),。廈門實時Real-time PCR供應(yīng)商

聚合酶鏈反應(yīng)的一個主要限制是，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴(kuò)增的引物,，需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息,。這意味著，通常情況下,，PCR用戶必須知道兩個單鏈模板中每個模板上目標(biāo)區(qū)域上游的精確序列,，以確保DNA聚合酶正確結(jié)合引物-模板雜交體，并隨后在DNA合成過程中產(chǎn)生整個目標(biāo)區(qū)域,。像所有酶一樣,，DNA聚合酶也容易出錯，這反過來會導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變,。PCR的另一個限制是,，即使是很少量的污染DNA也可以被擴(kuò)增,，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果。為了很大限度地減少污染的可能性,，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備,、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨的房間,。試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中,。應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。杭州微量PCR檢測技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù),。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列,。兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊,。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,。引物3‘端的堿基,，特別是很末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對,，很好選擇是G和C,。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點,，引入突變位點,，用生物素、熒光物質(zhì),、地高辛標(biāo)記,，加入其它短序列，包括起始密碼子,、終止密碼子等,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：定量PCR允許實時定量和檢測特定的DNA序列，因為它在合成過程中測量濃度,。有兩種方法可以同時檢測和定量,。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標(biāo)記的探針,。只有在探針與其互補DNA雜交后,，才能使用這些方法檢測DNA。一種有趣的技術(shù)組合是實時PCR和逆轉(zhuǎn)錄,。這種復(fù)雜的技術(shù)被稱為RT-qPCR,，允許定量少量RNA。通過這種組合技術(shù),，mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA,，并用qPCR進(jìn)一步定量,。這種技術(shù)降低了聚合酶鏈反應(yīng)終點出錯的可能性，增加了檢測與遺傳疾病如病癥相關(guān)的基因的機(jī)會,。實驗室使用RT-qPCR來靈敏地測量基因調(diào)控,。聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計：PCR反應(yīng)中有兩條引物,，即5′端引物和3′引物,。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同,；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補,。引物設(shè)計的基本原則：引物長度：15-30bp，常用為20bp左右,。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC很好隨機(jī)分布,，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。聚合酶鏈反應(yīng)的一個主要限制是,，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴(kuò)增的引物,，需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息。無錫骨頭定量PCR應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)很容易理解和使用,，并迅速產(chǎn)生結(jié)果,。廈門實時Real-time PCR供應(yīng)商

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板,，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá),。完整RNA 的提取和純化,，是進(jìn)行RNA 方面的研究工作，如Nothern雜交,、mRNA 分離,、RT-PCR、定量PCR,、cDNA合成及體外翻譯等的前提,。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即樣品細(xì)胞或組織的有效破碎,；有效地使白復(fù)合體變性,；對內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離,；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去,。但其中很關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性,。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑，提取總核酸,，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來,；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA 留在水相,。種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA 的丟失,，目前該方法的使用頻率已很低。廈門實時Real-time PCR供應(yīng)商