聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步驟：標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA,；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合,，形成局部雙鏈,。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性很好）的作用下,，以dNTP為原料,，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈,。每一循環(huán)經(jīng)過變性,、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法,，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,。像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯,，這反過來會導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變,。常州微量熒光PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,，PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加,?；蚬こ蹋荷锊牧稀猰RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄后成為cDNA（互補DNA）,，通過PCR擴增,。這里不是信使RNA，而是病毒RNA作為生物材料進行PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),。作用——體外將病毒RNA分子結(jié)構(gòu)進行修飾,，其次將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中，進行病,。RNA的表現(xiàn)形式：RNA病毒一般由蛋白質(zhì)和RNA組成,，現(xiàn)在看下RNA——一條核糖核酸長鏈，核糖核酸長鏈由無數(shù)個核糖核苷酸分子構(gòu)成,，其中,，一個核糖核苷酸分子由一分子磷酸、一分子核糖（一種五碳糖）,、一分子含氮堿基構(gòu)成,。脫氧核糖核苷酸分子比核糖核苷酸分子少了一個O分子。常州微量熒光PCRPCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列,。兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊,。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增,。引物3‘端的堿基,，特別是很末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對,，很好選擇是G和C,。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點,，引入突變位點,，用生物素,、熒光物質(zhì),、地高辛標(biāo)記,，加入其它短序列，包括起始密碼子,、終止密碼子等,。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：MgCl2濃度過高。可適當(dāng)降低其用量,。模板量過多,。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng，而基因組DNA則應(yīng)<200 ng,。引物濃度不夠優(yōu)化,。對引物進行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。循環(huán)次數(shù)過多,；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30,，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環(huán),。退火溫度過低,。電泳體系有問題：凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；凝膠沒有凝固好,；瓊脂糖質(zhì)量差,。若為PCR試劑盒則可能：由于運輸儲存不當(dāng)引起試劑盒失效；試劑盒本身質(zhì)量有問題,，如引物選擇,、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布,。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))：用于從RNA中擴增DNA,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：RNA和DNA的五碳糖，前者比后者多了一個O,，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同,，即O原子造成U和T的不同，U分子化學(xué)式C4H4N2O2,，T胸腺嘧啶化學(xué)式C5H6N2O2，現(xiàn)在將兩個分子式進行對比,，U比T多了CH2,，結(jié)合前面的核糖區(qū)別，還有一個O分子,，其余結(jié)構(gòu)相同,，那么O和CH2之間的聯(lián)系是什么?是什么導(dǎo)致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T,？若從結(jié)構(gòu)上說,，直接從U中加入一個CH2，得到了T,，這里面介入化學(xué)鍵的斷裂和重組,，但是這樣一來的話，即使U變成了T，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個O分子,，只是此時結(jié)構(gòu)是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C）,，形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了。此時將這種分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（亦或者蛋白質(zhì)）中,，表達的性質(zhì)一定不同于病毒表達的性質(zhì)?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成,。常州微量熒光PCR

聚合酶鏈反應(yīng)可以用于分析病癥,、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達水平的變化。常州微量熒光PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù),，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,，PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此,，無論是化石中的古生物,、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā),、皮膚或血液,，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大,，進行比對,。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。由1983年美國首先提出設(shè)想,，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生,。到2013年,，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。常州微量熒光PCR